黄连解毒汤对过氧化氢诱导大鼠皮层神经元损伤的保护作用

1、黄连解毒汤对过氧化氢诱导大鼠皮层神经元损伤的保护作用?142?中国医院药学杂志2005年第25卷第2期ChinHospPharmJ,2005Feb,Vol25,No.2黄连解毒汤对过氧化氢诱导大鼠皮层神经元损伤的保护作用吴彦.,孙建宁,于绍坤(1.北京中医药大学中药药理系,北京100102;2.北京维健生生物科技有限公司,北京)()39)摘要目的:观察黄连解毒汤有效部位(HIjDTAF)对培养皮层神经细胞过氧化氢损伤的保护作用.方法:体外培养新生大鼠皮层神经细胞,加入过氧化氢观察其对神经细胞的损伤及HLJDTAF的保护作用.结果:HLJDTAF610,305mg?kg可减少模型乳酸脱氢酶(LD

2、H)漏出率,305mg?kg还可提高模型细胞活性(P<I).o5;P<().01).同时HLJDTAF各剂量均可减少丙二醛生成,153mg?kg还可减少一氧化氮生成.结论:HLJDTAF对培养神经细胞自由基损伤具有显着的保护作用,其机制可能与抗脂质过氧化作用有关.关键词黄连解毒汤有效部位;过氧化氢;皮层神经元;细胞培养中图分类号R285.5文献标识码A文章编号10015213(2005)02014203ProtectiveeffectsofHuanglianJiedutangactivefractiononhydroperoxide-inducedinjuryincerebralc

3、orticalneuronalculturesWUYan,SUNJian-ning,YUShao-kun(1.DepartmentofTCMPharmacology,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;2.BeijingVitalCareBiothecInc,Beijing100039,China)ABSTRACT:0脚EcnVET0investigatetheprotectiveeffectsofHuanglianJiedutangactivefraction(HLJDTAF)onhydroperoxide(H202)

4、一inducedinjuryincerebralcorticalneuronalcultures.METHoDSCorticalneuronsofnewlybornratwerecuhuredinviVO.TheprotectiveeffectsofHIjDTAFonhydroperoxide-inducedinjurywereobserved.RESULTSHLJDTAF610,305mg?kgreducedtheleakagerateofLDH.305mg?kg_.increasedtheactivityofneuron,610.305,153mg?kgreducedtheproducti

5、onofMD八0Dl1LUSIONHIIDTAFprotectshydroperoxide-inducediniuryincerebralcorticalneuronalcultures,themechanismiSprobablyrelatedtothesuppressionofthegenerationofNOandreductionoflipidperoxideaction.KEYWORDS:HuanglianJiedutangactivefraction(HIJDTAF);hydroperoxide;cerebralcorticalneuron;cellculture黄连解毒汤源于唐?

6、王焘外台秘要,由黄连,黄芩,黄柏和栀子组成,为清热解毒代表方.近年中日两国对黄连解毒汤及其提取物用于脑血管病的基础研究与临床报道较多1q,提示本方治疗缺血性脑血管病有良好前景.本研究运用复方有效部位研究模式与方法4,利用大孑L树脂色谱技术分离制备了黄连解毒汤有效部位(HLJDTAF),并对该有效部位的药效学进行了系统研究.为进一步证实该药对自由基损伤的保护作用,本实验采用过氧化氢损伤大鼠皮层神经细胞的方法模拟氧自由基损伤,观察HIdDTAF对损伤的影响,探讨其对神经细胞的保护作用.1材料722型分光光度计(上海第三分析仪器厂);新生Wistar大鼠(24h)北京维通利华实验动物技术有限公司,合

7、格证号:SCXK(京)200200033;黄连解毒汤有效部位(HIjDTAF),黄连解毒汤流浸膏(HLJDTD),(北京中药学院中药化学系,HLJDTD每1mL相当于原药材1g);牛黄清心丸(NHQXW,同仁堂集团公司);乳酸脱氢酶(LDH),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所);DMEM高糖培养基,胎牛血清,胰蛋白酶(Gibco公司);马血清(Hyclone公司);HEPES(德国BM公司);胰岛素(上海生物化学制药厂);盐酸阿糖胞苷(cytarabinehydrochlride)(北京医科大学实验药厂);多聚赖氨酸(相对分子质量/p>

8、0),噻唑兰(thiazoylbluetetrazoliumbromide),牛血清白蛋白,台盼蓝(trypanblue)(美国Sigma公司);过氧化氢,(分析纯,北京化工厂);其他试剂均为国产分析纯.2方法2.1药物血清的制备药物血清的制备方法正常Wistar大鼠,随机分为6组.正常对照组,HLJDTAF610,305,153mg?kg组,HLJDTD4g?kg组和NHQXW1.6g?kg组.药物按剂量,每日分上,下午2次给药,正常对照组灌服0.5CMC1mL?(1()()g),第5次全量给药后2h颈总动脉取血,4保存4h后离心,(3000r?min)20min,取上清,混匀,56灭活30

9、min,过滤除菌,分装,一2()贮存.2.2方法和分组2.2.1大鼠大脑皮层神经细胞的原代培养无菌条件下分离出24h内乳大鼠大脑皮层,迅速放解剖液中,剔除软脑膜和血管,将分离出的皮层组织置于盛有解剖液的平皿内,用眼科剪剪成约300500m的脑作者简介吴彦,男,博士,助理研究员,电话812,E-mail:WUyan2003中国医院药学杂志2005年第25卷第2期ChinHospPharmJ,2005Feb,Vol25,No.2?143?片,终浓度为0.125胰酶,37消化30min.接种培养液中止消化2次,吹打分散细胞,将细胞悬液经2()()目金属网过滤,调整细胞数至

10、I.010L,0.4台盼蓝镜检存活率>95.将制备好的神经细胞悬液接种到0.001多聚赖氨酸处理过的培养板中或培养瓶中,置37,5二氧化碳培养箱中培养24h,待细胞贴壁后换培养液(全换),去除死细胞,以后23d换液1次,细胞培养至第4天.加入阿糖胞苷(终浓度为1()/mol?L)培养48h,以抑制非神经细胞过度增殖,48h后换新鲜的培养液继续培养.2.2.2皮层神经细胞过氧化氢损伤模型的建立取培养10d的神经细胞去除原培养液后,损伤组用无糖Earles液(mmol?L:NaCl116;KCl5.4;CaCI21.8;MgS(L7:H2O0.8;NaH2PO42:H2O2.6;NaHCO3

11、26.2;HEPES20.1;pH7.4)洗2遍,加入无血清培养液DMEM,加入终浓度为25,50,100,200,5()()tmmol?L过氧化氢培养1h后,DMEM洗2次,换上无血清的DMEM培养基,并置于37,5二氧化碳孵箱中继续培养24h.2.2.3MTT法测定细胞活性实验结束前4h加入MTT(终浓度为0.5g?L),吸去培养液,每孔加入二甲基亚砜200L,待孔内颗粒完全溶解后,移入96孔培养板中,用酶联免疫检测仪测定570nm处的光密度(0D).2.2.4HLJIDTAF对过氧化氢诱导原代培养神经细胞损伤的保护作用细胞培养与造模方法均同前,过氧化氢终浓度为200ptmmol?L.在过

12、氧化氢损伤前,给药各组各孔分别加入占总体积1()的HUDTAF610,3O5,153mg?kg;HLJDTD4g?kg和NHOXW1.6g?kg占总体积1()的含药血清,培养30min后,再加入过氧化氢损伤.对照组和模型组分别加入占总体积1()的空白血清.(1)乳酸脱氢酶活性测定:24h后收集培养液上清液100L,剩余培养液置一2()冰箱冻存5h后拿出化冻,按试剂盒说明书分别测定原上清液乳酸脱氢酶(LDH)的活性和培养板中剩余培养液冻融后的LDH活性,计算LDH漏出率.漏出率=(上清液LDH活性/冻融后细胞培养液中LDH活性)X1()().(2)细胞活性测定:方法同上;细胞上清液中氧化氮测定采

13、用硝酸还原酶法,以总硝酸盐(No!一/N03一)含量表示氧化氮浓度;MDA含量及SoD活性的测定:细胞用PBS洗2遍,每孔加入().1tool?LPBS,加入0.1mL1TritonX一100裂解细胞,培养板振荡使之溶解,3000r?min离心后,测定裂解液MDA和SOD.3结果3.1不同浓度过氧化氢对神经细胞损伤的比较结果显示:过氧化氢100500pmol?L可引起细胞损伤,表现为细胞活性降低.结果见表1.表1不同浓度过氧化氢对培养大鼠皮层神经细胞损伤(z-)Tab1InjuryofdifferentconcentrationOfH2(onhydroper-oxide-inducedinju

14、ryincerebralcorticalneuronalcultures(注:与对照组比较,P<O.oi;P<O.o53.2HLJIDTAF对过氧化氢诱导原代培养神经细胞损伤的保护作用结果显示,造模后,细胞活性降低,LDH漏出率增高,No和MDA含量增加(与对照组比较P<().01;P<0.05).HLJDTAF610,3()5mg?kg对过氧化氢损伤原代培养神经细胞有一定的保护作用,表现为减少模型LDH漏出率,305mg?kg还可提高模型细胞活性(P<().()1;P<O.05).同时HLJDTAF各剂量均可减少MDA生成,153mg?kg还可减少No生成

15、.结果见表2.表2HLJIDTAF对过氧化氢损伤原代培养神经细胞的保护作用(z-S,”=6)Tab2EffectofHLJITAFonhydroperoxide-inducedinjuryincerebralcorticalneuronalcuhures(zs.”6)删出率一模型组一1.160.1373.94.915.34.84.41.4HlJDTAF6101.220.1660.73.1a15.13.01.80.4a3051.400.21b61.410.7b12.07.32.00.6b1531.240.1166.512.86.12.9a2.41.4bHIJDTD4(HJ()1.320.1262

16、.83.8a8.54.【IbI.8o.6ag!:主!:!:!圭!:!:主:主!:注:与模型组比较,aP<o.O1,P<o.054讨论缺血时,兴奋性氨基酸递质的释放,膜去极化和细胞内Ca的增加,引起活性氧自由基和一氧化氮的产生L5j.活性氧自由基包括?o,H:和?0H,次黄嘌呤与XO反应或X与XO反应生成一,是缺血时产生自由基的主要途径,一进一步启动Haber-Weiss反应生成毒性更强的羟自由基.活性氧自由基产生的另一个途径是Ca钙调蛋白依赖性NoS的激活,同时生成No,No可与?ot反应生成?ONOO?活性氧自由基,No,?oN00一均引起细胞损伤.过氧化氢是一种较强的氧化剂,其

17、基本的细胞损伤机理是通过HaberWeiss反应生成?OH,诱发脂质过氧化反应,并持续为链式反应,使自由基反应扩增放大造成的_6_.本研究结果表明,过氧化氢损伤可使?144?中国医院药学杂志2005年第25卷第2期ChinHospPharmJ,2(R)5Feb,Vol25,No.2细胞活性下降,LDH漏出率增加,细胞裂解液脂质过氧化产物MDA升高,表明过氧化氢对神经细胞有直接的损伤作用.HLJDTAF可以升高受损细胞活性,降低LDH漏出率,表明其对神经细胞的自由基损伤有良好保护作用,HLJDTAF还可降低细胞上清液NO生成与细胞裂解液MDA的生成,这说明该药减轻自由基损伤可能通过减少自由基生成

18、的诱发因素(N0)而减轻脂质过氧化损伤.参考文献:1陈光亮,张秀荣,王钦茂.黄连解毒汤药理研究进展J.安徽中医学院,2001,2o(5):6769.r2泉山隆男.黄连解毒汤胶囊治疗脑中风后遗症的效果J.日本医学介绍,1997,18(2):).温跃才.加味黄连解毒汤治疗脑梗塞1tHJ例J.吉林中医药,1998.(1):2627.梁吉春,石任兵,刘斌.银翘散研究方法的新探讨J.北京中医药大学,1999.22(1):37.BeckmanJS,YeYz.ChenJ.Theinteractionofnitrieoxidewithoxygenradicalsandscavengerincerebralis

19、chemicinjuryj.AdvNeurol,1996,71(1):339.曾昭惠.张宗玉.自由基对线粒体DNA的氧化损伤J.生物化学与生物物理进展.1995,22:429,432.王德清.沈文梅,田亚平.等.羟自由基对细胞损伤作用的实验观察33.生物化学与生物物理进展,1995,22:278281.收稿日期2004-0428气相色谱法测定冬虫夏草多糖脂质体口服液中氯仿残留量官东秀,冯祚臻,邓莲芬,黄卡夫(1.玉林市红十字会医院.广西玉林537OO();2.广西壮族自治区疾病预防控制中心,广西南宁53()21)摘要目的:测定冬虫夏草多糖脂质体口服液中有机溶剂氯仿残留量.方法:采用气相色谱法,

20、电子捕获检测器(ECD);以G.nX-103(801(J()目.2m玻柱)为固定相;柱温:18();气化室温度:25O;检测器温度:250(ECD);栽气:氮气;灵敏度:7;衰减:8.结果:氯仿线性关系r为0.9991.平均回收率为96.86.RSD为0.49%(,3);5批样品中有机溶剂氯仿残留量均符合规定.结论:经方法学试验验证,该方法灵敏,准确,可靠,适用于冬虫夏草多糖口服液中氯仿残留量的测定.关键词气相色谱法;冬虫夏草多糖脂质体口服液;氟仿中圈分类号R283.1文献标识码A文章编号1ooi一5213(2O05)02014402Gaschromatographydetermination

21、ofresidualchloroformincordycepspolysaccharideliposomesoralliquidGUANDong-xiu,FENGZuo-zhen,DENGLianfen:.HUANGKafu(1.Red-crossHospitalofYulinCity.Guan.gxiYulin537O0O.China;2.GuangxiCentersforDiseasesControlandPrevention.GuangxiNanning53()21,China)ABSTRAL3:OBJECTIVETodeterminethecOntentsofresidualvolat

22、ileorganicsolvents.chlorofoITfl,incordycepsPolysaccharideliposomesoralliquid.ME3”HOi;Usinggaschromatographywithelectroncapturedetector(ECD);G.Dx_103(8()l(1Omesh.2m);Theintialtemperaturewas18(J;Theinjectionportanddetectortemperatureswere250;usingnitrogenascarriergas.RESULTSThecOrrelationrofchlorofoITfl