GH发酵培养实验方案

1、 rhGH工艺实验方案工艺实验名称rhGH发酵提高蛋白表达量培养实验申请人姓名辛鹏 杨江坤申请时间2011.9.271. 实验目的目前我公司rhGH菌体在裂解工序的蛋白表达量为9g/kg，为提高发酵菌体的蛋白表达量至10 g/kg，准备将发酵工艺控制参数进行调整，以增加单罐蛋白表达量，同时可以降低水、电、蒸汽、人工等生产费用支出，最终达到降低rhGH发酵生产成本，提高产量的目的。2. 实验背景目前裂解工序有1批GH二盐蛋白表达量达到10 g/kg，批号为F20110603，有3批GH二盐蛋白表达量达到9.5 g/kg以上，批号为F20110407、F20110501、F20110503、F20

2、110506、 F20110604、 F20110606，这几批的数据证明裂解二盐蛋白表达量达到10g/kg是可行的。针对上述几批裂解反馈的信息，我们认为发酵工艺阶段的控制参数可作适当调整，已达到裂解二盐蛋白表达量达到10g/kg。3. 可行性分析见附件4. 预期目标计划通过3批GH发酵培养，达到裂解工序10g/kg蛋白量的目的，并且各项参数可以稳定控制，保持批间的稳定。5. 实验过程为提高菌体收率，达到10g/kg蛋白表达量的目的，本次实验4方面进行发酵培养控制，包括：设备、物料、控制参数、培养时间4个方面，具体过程如下：（1）设备设备名称规格型号生产厂家使用地点恒温摇床4330NBS种子室

3、百级超净工作台SW-CJ天津津港净化设备厂无菌室紫外分光光度计UV1240型上海精密仪器有限公司发酵间复式光学显微镜YS100Nikon发酵间150L发酵罐D100德国贝朗公司发酵间2000L发酵罐D2000德国贝朗公司发酵间生化分析仪YSI2700美国YSI公司发酵间离心机Z-81德国赛普发酵液离心间（2）物料 150L罐发酵培养基配方名称使用数量磷酸二氢钠69.7g磷酸氢二钾185.5g硫酸铵306.3g硫酸镁189.4g柠檬酸三钠 61.3g氯化钾91.7g葡萄糖52.5g酵母粉126g水解酪蛋白2（11号）630g异亮氨酸（12号）24.5g微量元素溶液TE35ml氯化铁溶液35ml泡

4、敌10ml纯化水70L2000L罐发酵培养基配方名称使用数量磷酸二氢钠896g磷酸氢二钾2385g硫酸铵3938g硫酸镁2435g柠檬酸三钠 788g氯化钾1179g葡萄糖675g酵母粉1620g水解酪蛋白2（11号）8100g异亮氨酸（12号）315g微量元素溶液TE450ml氯化铁溶液450ml泡敌130ml纯化水900L2000L罐补料酪素配方名称使用数量酵母粉1265g水解酪蛋白1（10号）6147g水解酪蛋白2（11号）3254g纯化水定容至180L2000L罐补料葡萄糖配方名称使用数量葡萄糖140kg纯化水定容至280L发酵培养控制参数工序参数参数范围转种OD14.5-15.0(尽

5、量大些)菌体形态均一短杆且没有杂菌发酵温度37±0.3pH7.0±0.1(拐点除外)PO2PO2控制范围：小拐前PO225%，小拐后PO2最低点控制在15%以上，小拐结束至拐点最高PO2控制在15%-35%；拐点最高至8h，PO2控制在25%-45%；8h至11h PO2控制在35%-50%；11h- 16h PO2控制在45%-60%葡萄糖从转种到培养2小时每20分钟测一次糖, 要求残糖浓度时间残糖浓度(mmol/L)02.8mmol/L 30分钟40分钟1小时1小时20分钟1小时40分钟3.0-02小时0.5-0从2小时到放罐,根据溶氧的实际情况,来调节糖流加的速度。酪

6、素酪素泵流加功率为36%全过程不变发酵培养时间 ：延长至16小时备注1. 二代种子OD控制在2.3±0.1，以保证种子的批间稳定性，进而达到稳定发酵过程的目的2. 发酵培养前，对2000L发酵罐培养基底糖浓度进行测定，如果底糖浓度低于2.8 mmol/L，则手动调节糖补料泵进行补糖，使2000L发酵罐培养基底糖浓度达到2.8mmol/L3. 放罐时C源、N源的控制：C源的控制参照PO2、PH进行调节，N源的控制以补料体积至160L开始调节，将补N功率设置为20%4. 发酵后夜的罐压维持在0.3Mpa，轻易不作调整实验培养过程（1）、GHF20111001按7月份看罐方法看罐，培养时间

7、延长30min（包括3批GH发酵培养）；（2）、GHF20111002 PO2、残糖适当调整；PO2控制范围：小拐前PO225%，小拐后PO2最低点控制在15%以上，小拐结束至拐点最高PO2控制在15%-35%；拐点最高至8h，PO2控制在25%-45%；8h至11h PO2控制在35%-50%；11h- 16h PO2控制在45%-60%，补糖量最高17.5%；（3）、GHF20111003 PO2按照GHF20111002控制过程执行，补糖功率最高18%。实施时间：实施时间 GH 1GH 2GH 3实验负责人辛鹏 杨江坤执行人员发酵人员班组负责人车间主任生产总监附件GH裂解蛋白量达到10g

8、/kg可行性分析通过对2011年4-7月份数据进行分析，认为GH裂解蛋白量达到10g/kg是可行性，对4-7月份GH裂解蛋白量达到9.5g/kg以上批次进行分析。统计结果如下：批号裂解蛋白量F201104079.5g/kgF201105019.68g/kgF201105039.5g/kgF201105069.57g/kgF2011060310.2g/kgF201106049.5g/kgF201106069.56g/kg针对以上各批实际生产情况过程中的数据进行分析：发酵批号F20110603F20110604F20110606使用菌种号J20101201-NO2 H-6J20101201NO2

9、H-7J20101201-NO2 H-9一代培养OD值2.4 2.32.36 2.372.31 2.34二代培养OD值2.2 2.212.28 2.32.24 2.25150L罐最高PH值7.287.267.29150L罐大拐时间5小时16分5小时11分5小时15分2000L罐转种后OD值1.41.41.5开始补糖时间(h)28分25分25分拐点最高PH7.477.447.45拐点最低PO2值15.915.614.5最高补糖功率171717.5放罐时补糖量(L)159.1161.5164放罐时补氮量(L)153.6145149总补糖量(L)178.8180.5183.3总补酪素量(L)175.

10、6174.1174.2收获菌体量(kg)125.4125.4124.4发酵批号F20110501F20110503F20110506F20110407使用菌种号J20101201-NO1 H-39J20101201-NO2 H-3J20101201-NO1 H-42J20101201-NO1 H-34一代培养OD值2.31 2.322.35 2.362.31 2.332.35 2.34二代培养OD值2.16 2.152.32 2.312.3 2.282.24 2.23150L罐最高PH值7.347.287.247.31150L罐大拐时间5小时19分5小时19分5小时15分5小时20分2000L

11、罐转种后OD值1.41.51.51.4开始补糖时间(h)30分28分25分27分拐点最高PH7.437.367.427.37拐点最低PO2值17.217.217.318.3最高补糖功率17171717放罐时补糖量(L)156.3156.7157.1158.2放罐时补氮量(L)149.2150149.1154.5总补糖量(L)171.6175174.4177.8总补酪素量(L)172.4173.1173.4182.2收获菌体量(kg)122122126.7126通过以上各罐关注点数据进行分析得出：共性：1.都使用同一批菌种J20101201 2.一代OD2.3左右 3.二代OD2.25-2.3之间 4.150L罐最高PH值7.3左右 5. 150L罐大拐时间在5小时15-20分居多，各时间段补糖及时关注。 6.2000L转种后OD都大于1.4，150L发酵转种OD接近于15，或大于15. 7.2000L底糖较高，大于2.8mmol/L，0.5小时前应根据实际要求进行补糖，一般提前5分左右。 8.拐点最高PH值7.40左右。不打压最高点PH值，尽量在3.5小时或3.5小时5分内达最高点。 9.拐点最低溶氧控制应高于15%以上。 10.最高补糖功率可适当调整17-18. 11.放罐时补糖体积控制在155L以上，不能少了。 12.放罐时补酪素量150