吉林大学大学生生物试验技能竞赛比赛科目指引吉林大学

1、附件 1：吉林大学大学生生物实验技能竞赛比赛科目指南吉林大学大学生生物实验技能竞赛组织委员会二0四年三月Hucker 改进的革兰氏染色法鉴定微生物一、实验器材1、设备：显微镜尼康 YS100、YS2-H 2、材料：酒精灯、接种环、双层瓶内装香柏油和二甲苯 、载玻片、盖 片、擦镜纸、白纸、革兰氏染色液结晶紫染液、碘液、 95%乙醇、番红液、 生理盐水3、菌种：1大肠杆菌； 2枯草芽孢杆菌二、实验步骤1、涂片取一块洁净载玻片，在载玻片的左、中、右 3 处各滴加一小滴无菌生理盐 水，且均匀分布，用接种环以无菌操作方式分别从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜 面上挑取少许菌苔于左、右一水滴中，从大肠杆菌斜面和枯

2、草芽孢杆菌斜面上 各挑取少许菌苔同置于中间一水滴中，分别混匀并涂成薄膜。2、枯燥室温自然枯燥。3、固定涂面朝上，通过火焰 2-3 次。此操作目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片 上。4、初染滴加结晶紫液，以刚好将菌膜覆盖为宜，染色 1-2min，水洗。5、媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1min，水洗。6、脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加 95% 乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。7、复染用番红液复染约2min，水洗。8、镜检枯燥后，用油镜观察，比拟。正确结果：菌体被染成深紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏 阴性菌。三

3、、要求1、竞赛选题内容应在 2 小时内完成；2、载玻片要洁净无油迹；要用活泼生长期的幼培养物做革兰氏染色；涂片 不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；3、固定操作中，火焰不宜过热，以玻片不烫手为宜；4、革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。 色缺乏，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌；脱色时 间一般为 20-30s；5、显微镜使用时，物镜应从低倍到高倍依次转换；6、在显微镜视野下观察出两种菌大肠杆菌；枯草芽孢杆菌的形态，在 混菌中区分革兰氏阴性菌和阳性菌，并作图；7、写出实验报告，包括实验目的、原理、器材与材料、实验步骤、结果与讨论胰蛋白酶比活力的测定、实

4、验原理胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，该酶对于由碱性氨基酸如精氨酸，赖氨 酸的羧基与其他氨基酸所形成的肽键具有高度专一性。本实验利用胰蛋白酶 能催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯BAEE 水解生成N-苯甲酰-L-精氨酸BA 的原理，进行胰蛋白酶的活力测定。由于BAEE在253nm处的紫外吸收远低于 BA，而BAEE在胰蛋白酶的催化下逐渐生成 BA，反响体系在253nm的紫外吸 收值随之增加，因此可以以/ A253nm来计算胰蛋白酶的酶活力。胰蛋白酶的酶活力单位定义底物BAEE :在本实验条件下，以 BAEE为底物，每分钟使/ A253nm增加0.001所需的酶量定义为1个酶活力单位。二、实验器材1、设

5、备：分光光度计UVmini-1240 、旋涡混合器QL-901、微量移液 器。2、材料：试管、试管架、石英比色皿、记号笔、枪头1000微升、200微 升、10微升、5mL移液管、吸耳球、擦镜纸、滤纸、洗瓶、烧杯。3、试剂：胰蛋白酶样品浓度为 mg/mL，体积为Xml，需用Tris-HCI缓 冲液水自行稀释指定倍数后测定这里可以指定几个倍数，视实际酶活力 而定、0.05mol/L pH 7.8 Tris-HCl 缓冲液、2mmol/L BAEE。三、实验步骤1、取多支试管，分别标号为1、2、3、4等，1号为空白组，其余为测定 组，按照表1顺序参加各相关试剂。表1.胰蛋白酶活性测定加样程序试剂/m

6、L空白组测定组0.05mol/L，pH 7.8 Tris-HCl 缓冲液1.51.5待测胰蛋白酶0.1去离子水0.12mmol/L BAEE1.51.5总体积3.13.12、以空白组校正A253nm值至0，测定组中参加底物液BAEE后，立即混合均匀，用比色皿在UVmini-1240分光光度计上测定光吸收值 A253nm，同时记录 时间3、每间隔 1min 读取 A 253nm 值一次，至 6min 终止读数。4、 通过调节酶的浓度，控制测定组测得/ A253nm/min在之间数据 视为有效。5、计算每分钟平均A253nm增加值即/ A253nm/min。/ A253nm =【(A6min-A

7、3min)/3 + (A 5min-A 2min)/3 + (A 4min-A 1min)/31 /3四、要求1 、竞赛选题内容应在 2 小时内完成；2、微量移液器在吸取液体时防止平置、倒置等状态，防止液体流入移液器 腔体内；3、微量移液器用后要调至最大量程放置；4、测吸光度之前要分别用水和样品润洗比色杯；5、滤纸用于吸干比色杯上残留的液体，擦镜纸用于擦试比色杯的光面；6、比色杯用完后要用水清洗干净，并倒扣在平皿上；7、写出实验报告，包括实验目的、原理、器材与材料、实验步骤、结果与 讨论。8、实验报告需计算出/ A253nm/min、所用胰蛋白酶的总活力、胰蛋白酶的比活力离体蛙心及蟾蜍坐骨神经

8、腓肠肌标本制作一、实验器材1、材料：铁支架共用、双凹夹、竹试管夹、蛙板、玻璃板或光面瓷砖、 杭剪大剪刀 、组织剪、有齿组织镊、眼科剪、眼科镊、脊髓探针、玻璃分针、 器械盘、吸管、小烧杯、蛙心插管、手术线、培养皿。2、试剂：任氏液3、动物：蟾蜍二、实验步骤1、破坏脑和脊髓 取蟾蜍一只，左手持蟾蜍，用食指按压其头部前端，拇指 按压背部，使其脊柱伸直， 右手持脊髓探针从枕骨大孔处垂直向下刺入， 转向前 刺入颅腔， 充分捣毁脑组织。 然后将探针退至枕骨大孔处， 转向后刺入椎管捣毁 脊髓。此时如蟾蜍的四肢无肌张力、呼吸消失，即说明脑和脊髓已破坏完全。将蟾蜍仰卧位置于蛙板上，用有齿组织镊从剑突下夹起上腹部

9、皮肤 V 型剪 开；提起胸骨柄， V 型剪开胸骨并剪断，暴露心脏；用眼科镊夹起心包膜剪开 心包膜。2、心室插管 在左右主动脉下穿一条手术线备用。用眼科剪在左主动脉剪 一斜口， 将盛有任氏液的蛙心插管插入主动脉， 至动脉圆锥时略向后退， 于心室 收缩时经主动脉瓣进入心室。假设插管成功，管内液面会随着心跳波动。结扎、固 定插管，并将结扎线固定于插管侧钩上； 提起蛙心插管剪断周围血管等组织， 使 心脏离体。 吸净插管内血液， 用任氏液反复冲洗致液体澄清， 液面高度应高于心 脏 1-2 厘米。3、剪除躯干上部和内脏 将蟾蜍俯卧位置于蛙板上，左手在骶髂关节处提起 蟾蜍，使蟾蜍头和内脏自然下垂，右手持剪刀

10、，在骶髂关节水平上 1cm 处剪断 脊柱，并沿脊柱两侧剪除一切内脏和头胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及紧贴于 脊柱两侧的坐骨神经。4、皮肤剥离 用有齿组织镊夹住脊柱断端，右手提起其上的皮肤边缘，用 力向下剥去全部后肢的皮肤，把标本置于盛有任氏液的培养皿中。5、别离后肢 将标本腹面朝上放于蛙板，沿正中线用杭剪沿脊柱和耻骨联合正中线将标本一分为二，将别离后的标本浸入盛有任氏液的培养皿中。6、制备坐骨神经腓肠肌标本1游离坐骨神经 用玻璃分针沿脊柱旁游离坐骨神经，并沿坐骨神经沟 继续别离坐骨神经至腘窝处。 用玻璃分针仔细剥离， 眼科剪剪断坐骨神经的所有 分支，然后用杭剪剪断脊柱，仅保存约 1cm 与坐骨神经相连的脊柱。2完成坐骨神经小腿标本 将已手术别离的坐骨神经置于腓肠肌上，剪 掉膝关节以上的全部肌肉，然后在股骨中部用杭剪剪去上段股骨，保存约 1cm 的股骨，剩余的局部即为坐骨神经小腿标本。3完成坐骨神经腓肠肌标本将上述坐骨神经小腿标本在跟腱处穿线结扎后，于远心端剪断跟腱。 游离腓肠肌至膝关节处， 然后用组织剪剪掉其余的小 腿局部