谷丙转氨酶活性测定

1、实验十七实验十七 谷丙转氨酶活性测定谷丙转氨酶活性测定Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase 一、实验原理一、实验原理 氨基移换酶也称转氨酶氨基移换酶也称转氨酶, ,为广泛存在于生物为广泛存在于生物机体内的酶，其作用为催化机体内的酶，其作用为催化-氨基酸的氨基酸的- - 氨基氨基与与- - 酮酸的酮酸的- - 酮基互换。因此在氨基酸的合酮基互换。因此在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的种类甚多。有重要作用。转氨酶的种类甚多。 任何

2、一种氨基任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化，酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化，它们的最适它们的最适pHpH接近接近7.47.4。 在各种转氨酶中，谷氨酸在各种转氨酶中，谷氨酸- -草酰乙酸转氨酶草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）及谷氨酸（简称谷草转氨酶）及谷氨酸- -丙酮酸转氨酶（简丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）活力最强。称谷丙转氨酶）活力最强。 上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内，上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内，在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所梗塞等病变时，血清中转氨

3、酶活力显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。它们的催化反应如下：它们的催化反应如下：COOH COOH COOH COOH CHNH2+ C=O C=O + CHNH2CH3 (CH2)2 CH3 (CH2)2COOH COOH转氨酶 丙氨酸 -酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸 测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸上层析法等。在本方法中，谷丙转氨酶作用于丙氨上层析法等。在本方法中，谷丙转氨酶作用于丙氨酸和酸和酮戊二酸后，生成的丙酮酸与酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2,42,4 二硝二硝基苯肼作用生成丙

4、酮酸基苯肼作用生成丙酮酸2,42,4 二硝基苯腙。二硝基苯腙。 本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成量可以计算酶的活力。量可以计算酶的活力。二、实验用品二、实验用品 1、材料、材料新鲜动物肝匀浆。新鲜动物肝匀浆。2、试剂、试剂（1）0.1M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH=7.4） 取取0.1M KH2PO4液液50ml，0.1N NaOH液液39.3ml，再加蒸馏水再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。混匀即得。（2）丙酮酸钠标准液（）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子微克分子/ml）：）： 取取AR丙酮酸钠丙酮酸钠11mg溶解于溶解于50ml 0.1M磷酸缓

5、冲液磷酸缓冲液内（宜当日新配）。内（宜当日新配）。（3）谷丙转氨酶底物：）谷丙转氨酶底物： 取分析纯取分析纯酮戊二酸酮戊二酸29.2mg，DL丙氨酸丙氨酸1.79g置于小置于小烧杯内，加烧杯内，加1N NaOH约约10ml至完全溶解。用至完全溶解。用1N NaOH或或1N HCl校正其校正其pH=7.4，加加0.1M磷酸缓冲液稀释至磷酸缓冲液稀释至100ml，然后加然后加氯仿数滴防腐，在冰箱内可保存一周。此溶液每氯仿数滴防腐，在冰箱内可保存一周。此溶液每1.0ml含含 酮戊二酸酮戊二酸2.0微克分子，丙氨酸微克分子，丙氨酸200微克分子。微克分子。（4）2，4二硝基苯肼溶液：二硝基苯肼溶液：

6、将将AR纯纯2，4二硝基苯肼二硝基苯肼19.8mg加入加入200ml锥形瓶内，锥形瓶内，加加100ml 1N HCl液。液。2，4二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶放在暗处不时摇动，全部溶解后，滤入褐色玻璃瓶。并置于放在暗处不时摇动，全部溶解后，滤入褐色玻璃瓶。并置于冰箱中保存。冰箱中保存。（5）0.4N氢氧化钠液。氢氧化钠液。3、仪器设备、仪器设备 试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计三、方法和步骤三、方法和步骤1 1、肝匀浆制备：、肝匀浆制备： 取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏

7、干，称取肝脏0.50.5g g，剪成小块，置于玻璃匀浆管剪成小块，置于玻璃匀浆管内，加入内，加入4.54.5mlml预冷的预冷的pH 7.4 0.1 mol/LpH 7.4 0.1 mol/L磷酸缓磷酸缓冲液，制成冲液，制成10%10%肝匀浆，冰冻保存。肝匀浆，冰冻保存。 2 2、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制 取取6 6支试管分别用支试管分别用0 0、1 1、2 2、3 3、5 5标号，按下标号，按下表所列次序添加各试剂。表所列次序添加各试剂。 将试管于将试管于3737水浴中保温，平衡管内外温度水浴中保温，平衡管内外温度, , 向各管内加向各管内加0.50.5ml 2ml 2，4 4二硝基苯

8、肼后再保二硝基苯肼后再保温温2020分钟，分钟， 最后分别向各管内加入最后分别向各管内加入0.40.4N NaOH 5N NaOH 5毫升，毫升， 在室温下静置在室温下静置3030分钟后，分钟后， 以以0 0号管做号管做“空白空白”用用520520nmnm进行比色，读出进行比色，读出光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。值为纵坐标，画出标准曲线。管号管号试试 剂剂 012345丙酮酸钠标准液丙酮酸钠标准液/ml0.000.050.100.150.200.25谷丙转氨酶底物谷丙转氨酶底物/ml0.500.450.400.35

9、0.300.25磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液(0.1M pH7.4) /ml0.100.100.100.100.100.1037水浴中保温，水浴中保温， 平衡管平衡管内外温内外温度度2，4-二硝基苯肼二硝基苯肼/ ml0.500.500.50 0.50 0.50 0.50 保温保温20分钟分钟NaOH (0.4N)/ml555555静置静置30分钟分钟A520nm表表1.1.丙酮酸钠标准曲线的绘制丙酮酸钠标准曲线的绘制1 测定管测定管2 “空白空白”对照管对照管谷丙转氨酶底物谷丙转氨酶底物/ml0.500.5037水浴保温水浴保温10min，使管内外温度平衡，使管内外温度平衡稀释肝匀浆稀释肝匀浆/ml0.1037水浴保温水浴保温30分钟分钟2,4二硝基苯肼试剂二硝基苯肼试剂/ml0.500.50稀释肝匀浆稀释肝匀浆/ml0.10保温保温20分钟，冷却分钟，冷却NaOH (0.4N) /ml5.05.0室温下静置室温下静置30分钟分钟A520nm表表2.2.谷丙转氨酶酶活力的测定谷丙转氨酶酶活力的测定2 2、谷丙转氨酶酶活力的测定、谷丙转氨酶酶活力的测定四、实验结果四、实验结果用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活力单位用光