壬基酚对家兔丙二醛及谷胱甘肽过氧化物酶的影响

1、壬基酚对家兔丙二醛及谷胱甘肽过氧化物酶的影响壬基酚对家兔丙二醛及谷胱甘肽过氧化物酶的影响摘要：本试验以被喂养壬基酚的不同月龄家兔作为试验材料，通过家兔不同器官中丙二醛及其谷胱甘肽过氧化物酶含量的测定，来分析壬基酚对于家兔的影响。结果表明：家兔血浆、肌肉、肝和肾中丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶含量发生了不同程度的改变，壬基酚可影响机体的抗氧化防御系统。关键词：壬基酚；家兔；丙二醛；谷胱甘肽过氧化物酶Influence Of Nonylphenol On Malondialdehyde And Glutathione Peroxidase Of The Rabbit Abstract： This st

2、udy was mainly aimed to evaluate the effect of nonylphenol to the malondialdehyde (MDA) and glutathione peroxidase (GPX) of the Rabbit. One-，three - and fivemonth-old rabbits were randomly divided into control group which was administered by water without any chlorine and experiment group which was

3、administered by 0.5mg/L nonylphenol solution. There were six rabbits in every group. After 21 days, the rabbits were killed for the sampling of plasma, liver, muscle and kidney. The results showed that the concentration of MDA and the activity of GPX were changed, and therefore nonylphenol can alter

4、 lipid peroxidation and the antioxidant defense system.Key words：Nonylphenol; Rabbit; Malondialdehyde; Glutathione peroxidase目 录前言11.材料与方法21.1 动物材料21.2试验方法22结果与分析32.1壬基酚对不同月龄家兔MDA的影响结果52.2壬基酚对不同月龄家兔GPX的影响结果53讨论53.1壬基酚对不同月龄家兔MDA的影响53.2壬基酚对不同月龄家兔GPX的影响6参考文献7致谢10前言壬基酚（Nonylphenol，NP）是一种新近认识的环境内分泌干扰物，被广

5、泛的应用于工业生产中，例如清洁剂、油漆、杀虫剂的生产，还可作为工业生产中的抗氧化剂以及一些个人护理用品的乳化剂，少量壬基酚被应用于食品包装方面透明塑料膜的制造。壬基酚的化学性质稳定，难降解，研究证实壬基酚在60的有氧环境中可以经微生物降解，但在无氧情况下壬基酚仍难于降解1。由于壬基酚的脂溶性和难降解的特点，水生生物可作为其富集的贮存库2。一方面通过水体的传递积累于生物体内，另一方面通过食物链的传递而发生放大作用3。壬基酚在河水、水生附着生物和底栖生物之间的生物积累与放大倍数在18-1200倍之间。而底栖生物的相对最大积累率可达106倍，环境激素通过食物链的生物放大作用比通过水体的传递对鱼类等水

6、生生物的危害更大4。如大西洋鲑（Salmo salar）可以通过洄游将环境雌激素转移到阿拉斯加淡水湖泊，从而使环境雌激素浓度高出其他湖泊2倍5-6。在生态系统中，这类物质通过生物浓缩、生物积累和生物放大等途径增大浓度，实现对生物和人类的更大危害。壬基酚可对生物体产生广泛的不良作用。近几年来通过体内外试验研究发现，壬基酚对啮齿类动物的多种器官、系统存在毒性作用，其中对于生殖系统的研究比较透彻。当壬基酚剂量为250mg/（kg·d）时，经口给予啮齿类动物时可引起明显的睾丸损害，壬基酚能降低雄性大鼠生殖系统附睾的重量，导致精子密度和睾酮水平降低与促黄体素、促卵泡素水平的增加，并且精巢中细胞

7、凋亡的数目随着壬基酚浓度的增加而增加7。壬基酚可以通过模仿或是调节内源性激素系统影响正常的脑功能。Obata等研究发现壬基酚可以通过雌激素受体的作用，诱导大鼠纹状体内羟自由基（·OH）的形成8。在体试验进一步证明了壬基酚对于中枢神经系统的正常功能有一定干扰作用。通过对卵巢切除大鼠皮下注射剂量为50 mg/（kg·d）的壬基酚发现，壬基酚能够通过影响孕激素受体系统改变皮质功能9，也能够通过影响腺垂体水平，抑制卵巢切除大鼠促黄体素的分泌10。在免疫系统中，体内和体外细胞试验都证明壬基酚能通过改变胸腺细胞Fas和FasL的表达诱导细胞凋亡来影响免疫功能11、12。壬基酚还可通过激

8、活caspase-3以及线粒体去极化诱导胸腺细胞的凋亡13。除了对生殖系统以及免疫系统的毒性研究以外，壬基酚还被发现可以作为细胞转化的助剂，导致体内癌症的发生14，诱导成熟大鼠急性肝毒性作用15。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂质过氧化的最终分解产物之一,其含量变化可在分子水平上指示生物体的氧化损伤程度16 。因此通过检测机体内MDA含量变化，可以直接反映出机体内脂质过氧化的程度，而且能间接的反映出机体细胞受自由基攻击损伤的程度17。生物体抗氧化酶防御系统主要包括超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、谷胱

9、甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GPX）等，其主要功能是清除活性氧自由基18-21。谷胱甘肽过氧化氢酶（GPX）是生物机体内重要的抗氧化酶之一，它可以消除机体内的过氧化氢及脂质过氧化物，阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，是生物体内重要的活性氧自由基清除剂 22。在机体清除自由基的过程中，抗氧化酶起着重要的作用。GPX能催化H2O2 和脂质过氧化物还原，防止脂质过氧化物对机体生物膜和组织的损伤，并防止脂质过氧化物进一步水解为有害物质MDA。因此MDA和GPX的含量变化可在分子水平上指示生物体的氧化损伤程度23，24 。毒理学研究表明生物体GSH 和MDA 含量变

10、化对化学物质反应灵敏，且测定简便、不易受分析条件影响，常作为化学物质生态毒性的评价指标25，26。王志成27等人发现氟中毒会使体内起抗氧化作用的SOD、GPX等酶的生物活性受抑制，使自由基在体内大量蓄积而致脂质过氧化作用增强。众多试验研究也发现氟可对动物多种组织产生脂质过氧化损伤28-34。目前有关壬基酚的研究主要集中在对于内分泌、生殖和发育、促癌作用、免疫影响等方面，而关于壬基酚对动物机体理化的影响尚未见报道。因此本试验以家兔为试材，检测喂养了壬基酚的家兔体内MDA及GPX含量的变化，为进一步深入研究壬基酚对动物机体影响的研究提供参考依据。1材料与方法1.1 动物材料 试验所用健康成年家兔均

11、购于大庆春蕾饲养场，用长春希望兔饲料喂养。1.2 试验方法动物材料的处理健康家兔36只，1月龄、3月龄和5月龄各12只。饲养室预饲养一周后随机分成对照组和处理组，每组6只。对照组喂养除氯自来水，处理组喂养0.5mg/L壬基酚溶液，喂养21天。动物采样和样品制备速眠新麻醉家兔：家兔肌肉注射速眠新，注射后5-10分钟麻醉。如果第一次给药量不足，可再加大给药剂量，使其麻醉。心脏取血：将兔仰卧固定在手术台上，将心脏部位被毛剪去，用碘酒酒精消毒皮肤，选择心搏最明显处穿刺，针头刺入心脏后即有血液涌入注射器中。取得所需血量后，迅速将针头拔出，将血液转入肝素处理的离心管中。组织采样：注射过量麻醉剂处死家兔，再

12、解剖取出肝、肌肉和肾。血液样品制备：将取出的血液3000r/min离心10min，取血浆，装入离心管中液氮速冻后置于-70冰箱保存，以待用于生化指标的测定。组织块样品制备及处理：将取出的组织块剪碎混匀后装入离心管中，经液氮速冻后置于-70冰箱保存，以待用于生化指标的测定。测定前，取出组织块，称取肌肉、肝、肾分别为1g、0.5g、1g，将其置于研钵中研磨后用于冷的0.9%生理盐水稀释匀浆，制成的组织匀浆浓度分别为10%、20%、20%。将组织匀浆3000r/min离心10min取上清，用于生化指标的测定。丙二醛含量的测定参照测试盒说明书提供的方法，制备标准管，标准空白管及测定管。将其混匀之后，9

13、5水浴40min，取出后用流水冷却，然后4000转/分，离心10min，取上清，532nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。1.2.4谷胱甘肽过氧化物酶的测定参照测试盒说明书提供的方法将对照管与测定管进行酶促反应。混匀后，37水浴，预温5min，分别加入37预温的试剂一100L。然后37水浴准确反应5min后分别再加入试剂二2000L，对照管再加200L的试剂盒样品。混匀后，4000转/分，离心10min，取上清1ml做显色反应。之后进行混匀，室温静置15min后，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。计算公式（1）MDA含量活力的计算：组织MDA含量（nmo

14、l/ mgprot）=（测定管OD值-标准空白管OD值）/（标准管OD值-标准空白管OD值）×标准品浓度（10nmol/mL）÷蛋白含量（mgprot/ml）血浆MDA含量（nmol/ mgprot）=（测定管OD值-标准空白管OD值）/（标准管OD值-标准空白管OD值）×标准品浓度（10nmol/mL）×样品测试前稀释倍数（2）GPX活力的计算：组织GPX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（20umol/L）×稀释倍数（5*）÷反应时间÷（取样量×样本蛋白含

15、量）血浆GPX活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（20umol/L）×稀释倍数（5*）×样本测试前稀释倍数1.2.6 数据处理所得数据用SAS V8.0统计学软件包进行处理分析，壬基酚处理对各组的影响使用一般线性模型的双因素方差分析，而多重比较使用邓肯氏法（Duncans）。2结果与分析2.1壬基酚对不同月龄家兔MDA的影响结果如表1-4所示，双因素方差分析表明，壬基酚的处理对血浆、肌肉、肝和肾中MDA含量的变化没有显著作用（P血浆=0.121，P肌肉=0.544，P肝=0.541，P肾=0.274），但是月龄却有显著作

16、用（P血浆=0.001，P肌肉=0.009，P肝=0.000，P肾=0.000）。三月龄家兔的血浆MDA含量明显高于一月龄和五月龄。肌肉中MDA随年龄增长含量升高。一月龄家兔的肝中MDA含量明显高于三月龄和五月龄。肾中MDA则随月龄增长含量升高。表1壬基酚对家兔血浆中MDA含量的影响（单位：nmol/ ml）一月龄三月龄五月龄平均值对照组67.21±35.92145.42±14.8695.17±27.59102.60a试验组103.41±31.77170.62±37.19125.11±21.46133.05a注：同一行列肩标小写字母不

17、同者表示差异显著（P0.05），相同或无表示差异不显著（P0.05）以下各表同上表2壬基酚对家兔肌肉中MDA含量的影响（单位：nmol/ ml）一月龄三月龄五月龄平均值对照组85.02±24.60106.54±4.06159.32±52.37116.96a试验组84.49±30.22133.22±25.20168.89±16.64128.87a表3壬基酚对家兔肝中MDA含量的影响（单位：nmol/ ml）一月龄三月龄五月龄平均值对照组32.26±9.3412.69±1.1211.10±1.6418.68a

18、试验组24.43±1.2414.32±1.3413.87±3.4017.54a表4壬基酚对家兔肾中MDA含量的影响（单位：nmol/ ml）一月龄三月龄五月龄平均值对照组3.30±0.324.75±0.539.27±0.595.77a试验组3.650±0.364.91±0.2310.09±1.136.22a2.2壬基酚对不同月龄家兔GPX的影响结果如表5-8所示，双因素方差分析结果表明，壬基酚的处理对血浆、肌肉和肾中GPX含量的变化没有显著作用（P血浆=0.554，P肌肉=0.776， P肾=0.942）

19、，对肝中GPX含量的变化有显著作用（P肝=0.002），但是月龄却有显著作用（P血浆=0.006，P肌肉=0.000，P肝=0.000，P肾=0.000）。五月龄家兔的血浆GPX含量明显高于一月龄和三月龄。三月龄家兔的肌肉中GPX含量明显高于一月龄和五月龄。五月龄家兔的肝中GPX含量明显高于一月龄和三月龄。肾中GPX的含量随月龄的增长而降低。表5壬基酚对家兔血浆中GPX含量的影响一月龄三月龄五月龄平均值对照组11.50±3.9715.63±1.0921.88±2.9516.34a试验组15.71±3.2216.72±2.4419.63±

20、;2.2517.35a表6壬基酚对家兔肌肉中GPX含量的影响一月龄三月龄五月龄平均值对照组1285.75±234.552630.04±192.371879.16±250.661931.6a试验组1468.41±169.932429.44±123.522001.03±169.041966.3a表7壬基酚对家兔肝中GPX含量的影响一月龄三月龄五月龄平均值对照组228.37±28.96230.76±13.68398.86±25.53286.00a试验组206.39±11.27226.80±9

21、.76317.71±14.34250.30b表8壬基酚对家兔肾中GPX含量的影响一月龄三月龄五月龄平均值对照组127.95±2.52104.77±6.8692.753±5.01108.49a试验组132.18±5.35106.48±12.0587.909±4.31108.86a3讨论3.1壬基酚对不同月龄家兔MDA的影响正常情况下，机体活性氧自由基由细胞新陈代谢不断产生，不断清除，两者处于平衡状态。当活性氧自由基的产生超过机体防御体系的清除能力或机体的防御体系受损而不能发挥正常功能时，自由基会对细胞形成氧化损伤。活性氧自由基

22、对机体造成的重大损害之一是其代谢产生脂质过氧化。机体内存在着大量的不饱和脂肪酸，极易受到过氧化作用的损伤。脂质过氧化的损伤途径为:氧自由基+细胞膜脂质脂质过氧化反应过氧化脂质丙二醛+细胞成分脂褐质。MDA 是脂质过氧化反应链式终止阶段产生的小分子产物，是目前公认能反映氧自由基产生及引发的脂质过氧化反应的间接指标，其含量可以间接反映自由基的产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度35。而且，脂类过氧化产物MDA能与膜上的蛋白质氨基酸残基或核酸反应生成Shiff碱，增大膜的透性，促进膜的渗漏，降低膜的稳定性，从而使各种细胞器膜的结构与功能发生紊乱，严重时可导致细胞死亡36，因此可反映其对组织损伤的严

23、重程度，也是目前反映机体氧化损伤最具代表性的指标。肝脏在机体内具有特殊的解剖位置、组织结构与生理生化特征，是最易作为外来化学物的毒作用靶器官。肝脏是一个被血液充盈的器官，与血液循环系统密切相连，由于肝脏存在门静脉与肝动脉两套入肝血管，分别接受来自胃肠道静脉血液与体循环的动脉血液，化学物质无论从何种途径进入机体，最终均可通过血液循环迅速达到肝脏，尤其从消化道吸收的化学毒物，在进入血循环前毒物首先与肝脏接触。因此，当机体接触外源性毒物时，肝脏比其他器官更常发生毒性反应。因而长期的壬基酚的处理刺激，血细胞产生的活性氧将升高，大量活性氧的积累可能进而导致了细胞的氧化损伤，引发脂质过氧化作用，并因此形成

24、脂质过氧化物37。因此肝脏脂质过氧化作用增强，抗氧化能力下降，造成了肝脏氧化与抗氧化防御机制之间的失衡，使机体处于氧化应激状态，从而诱发肝脏的氧化损伤，因此家兔肝脏中MDA的含量应该有显著降低。然而，本试验肝脏中MDA的含量对照与处理后的试验结果没有明显差异，且处理后家兔MDA含量有所降低，表明壬基酚对其没有产生显著作用。大量动物试验研究提示，大鼠血浆内的SOD随年龄明显降低，而MDA显著升高38 。本试验结果发现不同月龄家兔血浆肌肉和肾中MDA含量总趋势随年龄增加，这一检测结果与其它文献报道的MDA随年龄而增加相一致，从而表明壬基酚并没有对其产生严重的影响。但是也可能由于本试验中壬基酚处理的

25、时间过短，或者浓度不够大，对机体生理系统基本无影响，没有造成生物体的氧化损伤程度。对于个别年龄段的MDA含量有较大差别，显著增高，可能由于此年龄段家兔生长太快所致。3.2壬基酚对不同月龄家兔GPX的影响GPX 是生物体内广泛存在的一种重要的清除H2O2 和许多有机氢过氧化物的酶。它能催化H2O2 和脂质过氧化物还原，防止脂质过氧化物对机体生物膜和组织的损伤，并防止脂质过氧化物进一步水解为有害物质MDA。大量动物试验研究提示，大鼠血浆和肝内的GPX随年龄明显降低。本试验结果发现不同月龄家兔血浆、肌肉和肝中GPX含量总趋势随月龄增加，肾中的GPX含量则随年龄而降低，这一检测结果与其它文献报道的血浆

26、和肝内GPX随年龄而降低不一致，可能由于本试验家兔年龄偏小，快速生长刺激了机体内GPX的产生，影响GPX含量。然而，血浆、肌肉和肾对照与试验组没有明显差异，表明壬基酚对其没有产生严重的影响。壬基酚对其没有影响可能由于壬基酚处理的时间过短，或者浓度不够大，没有造成生物体的氧化损伤程度。GPX是体内重要抗氧化酶，SOD歧化O2形成的H2O2、H2O2R、ROOH分别与还原型谷胱甘肽在谷胱甘肽过氧化物酶作用下形成H2O、RH和毒性较小的ROH，起到清除自由基的作用39。处理组家兔GPX活性较对照组有不同程度的降低。正常情况下，肝脏代谢过程中产生一定量的自由基，但可被抗氧化自由基物质所清除，二者之间处

27、于平衡状态，不造成肝脏组织的损害。谈冶雄等40测定慢性活动性肝炎、肝硬化、肝癌等肝组织中的GPX活性，结果均显著低于肝功正常者,表明损伤过程中GPX活性受抑制。血浆谷胱甘肽依赖酶的活性在氧化剂增高时出现，并且从损伤的肝细胞中释放到血清，因此GPX 是肝细胞损伤的超级标志41。当肝脏有毒物质增高时，能影响肝脏的正常生理功能，从而使血液和体液中硒的浓度下降，谷胱甘肽过氧化物酶的活性降低。这与本试验结果相似，反映了家兔肝脏GPX清除活性氧自由基的能力降低，增加了脂质过氧化程度，对肝细胞具有破坏作用。表明，壬基酚降低组织细胞抗氧化能力，造成自由基损伤。综上所见，本研究通过测定壬基酚对不同月龄兔子血浆、

28、肝脏、肾脏和肌肉中MDA和GPX含量的影响，发现长期饲喂壬基酚后引起兔子血浆、肝脏、肾脏和肌肉中MDA含量的升高，而在GPX的含量发生了不同程度的改变，说明壬基酚能增强机体内脂质过氧化的程度，对机体产生不显著的伤害，表明壬基酚可以影响兔子机体的氧化与抗氧化系统。参考文献1 范奇元，丁训城，蒋学之等，消化道摄入壬基酚在大鼠体内的分布与清除J环境与职业医学，2002，19（2）：2282302 杨再福，赵晓祥环境雌激素对水生动物的影响研究进展J生态环境200514（1）：1081123 Zou E Current status of environmental endocrine disrupti

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