课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定

1、课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定基因敲除小鼠的pcr鉴定、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历 史，经典技术如DNA原核显 微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰， 在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百 计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍 然存在一些难以 克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和

2、TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi 和 Smithies 在 1987 年根据同源重组(homologous recombination )的原理，首次实现了 ES的外源基因的定点整合(targeted integration ),这一技术称为"基因打靶"(gene targeting )或"基因敲除(gene knockout )，利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠 (KOMice: knockout mice );由于这

3、一工作，Capecchi 和 Smithies 于 2007 年 与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组(homologous recombination )定义:是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的 DNA分子之间或 分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异 性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图 1所示：Homologous Recombination：Gent tar(jetin(j vector:Positive se

4、leclable markerGenomic DMA：Target GeneRegion removed from genomeneoModilied genomic DNAReg ton inserted inlo 那 due自图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图制作流程ickP bip构建Knoc IcoutiE通过电转将K coclt0Mt蜕体在再陪在的第停下遵行EG培养导人 ES 细胞中Bi3PCRAlSauth?inSJ¥?获溥R（XKkg E驿施将鼻胚移睡附孕母以体内生产出废含体"i后与野生型小*汆交荻得G畲于Knotkout小11通L1与交萩些?Knocko

5、ut图2.基因敲除鼠制作过程示意图1. Knockout载体设计与构建根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 片段都重组到带有标记基因（如neo基因，TK基因等）的载体上，成为 重组的Knockout 载体。野生型小鼠基因组exonlexon2NeoRexon3exonJexotarget vectorNeoR2. Knockout ES 细胞筛选Knockout载体测序验证正确后，将载体线性化，然后电转入ES细胞，通过载体上的正负筛选基因获得阳性的Knockout ES 克隆。选取PCR 鉴定打靶载体正确插入的ES 基因组 DNA 用于 Southern B

6、lot 鉴定，将Southern Blot 鉴定的 Knockout ES 扩大培养并液氮保存。3. Knockout ES 细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠扩增经鉴定插入或置换片段位置正确的Knockout ES 细胞， 以囊胚显微注射的方式将一定数量的Knockout ES 细胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后将囊胚移植到假孕的小鼠子宫中。待后代小鼠出生后，通过小鼠的毛色中来源于ES 细胞毛色的比例判断嵌合程度的高低，以及该小鼠的后代中可能获得生殖系传递能力。4. 由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系Knockout 小鼠将嵌合体小鼠与适当品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通过PCR 方式检测小鼠是否含有打靶

7、序列。如有，则该小鼠为具备生殖遗传能力的Knockout 小鼠（F1 代鼠）。5. Knockout 小鼠生殖系传递鉴定将嵌合体小鼠和适当品系野生型小鼠交配，通过后代小鼠毛色或PCR 基因型鉴 定的方法验证嵌合体小鼠生殖系传递能力。四、基因敲除常见方法、常规基因敲除鼠（Conventional KnockoutZ345-Wt AileEe I115Targeting Vector /+-用忖虱口)疹?5 arm -5 4kb3 arm -3 4kb17"k5Targeted Allele h卜N n时 ). KO Allele: k ?(after Cre)'卜 LojiPH

8、omWogy grrnExon常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能 区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表 达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的 影响，而且这个基因没有胚胎致死性。、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout3Wt AlleleTargeting VectorTargeted AEleieCondi. KO Atle Ie(after Flp)Condr KO Allete(after Cre)卜 ILoxPHomology rmcKO region条

9、件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个 loxP位点放到目的基因一个或几 个重要的外显子的两边。该小鼠和表达 Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达 完全正常。当和组织特异性表达 Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织 或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该 基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能、基因敲入小鼠（Knockin ）Wt AlleleTargeting Vector5 3rnn 51 kb h cDWA 25kUTargeted Allele1 231a1b 21 31b 2KI Allele

10、(after Flp'1a-jlb 2> IT卜 LoxPNgmcbgy arm Human cDNA I Exor基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点， 使 用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。获得嵌合体及之后品系纯化详细流程:液台坏小鼠与野生型小鼠杂交亲合子ES来源魅来源Kex35小鼠野生型小朋野生型小鼠毛色鉴诲时代鉴在杂合于Krot kout小鼠东治于F1代K nocka ut小鼠后交PCR3EE纯合子杂合孑Knockout小鼠”Knockout/，鼠野生型小鼠这项技术中设计特异性的ZFN是

11、最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶(off target ),也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用 ZFN技术进行小鼠的基 因修饰还无法完全取代传统技术。、TALEN技术制作基因敲除鼠TALEN技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意 DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了 ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZF

12、N相等或更好的灵TALEN-COOHNG=T MD=C Nt-A =G/A口oub* siTtd uf日ak活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用 技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术34 aa repeats *,.i 中/ E .” ”B喟一LTPEaVVAlASNGGGKOALETVQRLLPVLCQAHG TAL模块及对应腌基136aa63aaTALEN MHlT' I I I TT! I I： ! | ；GQQHNLS7AL序列识别模块-yrrfTf i I I I口 tg7t ggctttgatgctstt actggaaattcactgt a

13、agttaacctagttcgggccACAA CCGAAACTACGACAA IflTCCGGAGTGACA TTCAATTGGAICAAGCCCGGHue /-fonxjfogoun Entf- Joining- NHEJTRfget&a眄i白必倒班tQ丑in - 7/；of NHEJ千 fy w* 出 frams 币理六、常见问题与解答1.什么是ES细胞显微注射?答： 胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小 鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型

14、小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得 50% 继承了目的基因的后代。2. 嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产 生排斥反应,相互间处在嵌合状态。在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体 也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。3. 条件性敲除的

15、原理？答： Cre-LoxP 系统是源于P1 噬菌体的一个DNA 重组体系,由 Cre 酶和相应的LoxP 位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA 序列处 （LoxP 位点 ）,该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA 片段删除。基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP 序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP 系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别 LoxP位点将抗性标记基 因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子

16、 小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选 子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。4. 如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因， 则称为嵌合体动物。它的鉴定主要 根据毛色去鉴定。注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因 此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。5. ROSA26与定点插入？答：利用同源重组技术，把外面的 cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入 到ROSA26位置。ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点 不会影响其他基因的表达。七、行业领先企业、% * TbconicTaconic Farms,Inc. 成乂于1952

17、年，是位于纽约哈得孙河谷地区的一家家族企业。自成立以来，公司一直 是世界上最大的实验室啮齿动物供应商之一，在持续生产高品质、定义明确的大鼠和小鼠方面拥有良好的口碑。Taconic在转基因小鼠的定制设计和生产、小鼠和大鼠育种、屏障系统、基因和动物健康方面的专业经验为利用活体模型开 展药物开发的研究人员提供支持。Taconic在美国和欧洲设有六个育种工厂和三个服务实验室，员工人数超过1000名，致力于从事技术创新。赛业生物科技是目前国内探生网 提醒:最大的转基因/基因敲除鼠技术服务供应商，旗下 的赛业转基因动物中心是国际顶尖的转基因/基因敲除模式动物中心，中心拥有 数千平方米 实验场地，动物种群规模超过10万只，每年可构建转基因鼠模型3000例及基因敲除鼠模型300例，累计构建转基因/基因敲除鼠模型数千例。中心主要