灵芝漆酶基因的克隆

1、灵芝漆酶基因的克隆摘要：综合运用苯胺蓝平板脱色法和愈创木酚法对实验室各菌种是否会产木质素降解酶进行简单定性分析。而后，运用基因组步行技术去克隆到一个全新的灵芝漆酶结构基因和其对应的全长cDNA,并对其序列进行分析。关键词：定性分析，基因组步行，漆酶结构基因漆酶（英文名称:Laccase CAS 编号：80498-15-3）是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。 漆酶其独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用,作为高效

2、的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段。漆酶构成的生物检测器主要有两种:漆酶电极和漆酶酶标。本文利用漆酶Cu离子结合区氨基酸序列高度保守特点，设计简并引物，综合运用基因组步行等分子生物学技术从灵芝中克隆到一个全新的漆酶基因。 1.实验材料1.1 酶和试剂限制性内切酶、限制性内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶。4种dNTP和One Step RTPCR Kit，TRIzol试剂，Oligotex mRNA Mini Kit，DNA纯化试盒。愈创木酚、苯胺蓝。2.1.2 菌株毛绒鬼伞 0901大肠杆菌 XL10-Gold载体 pMD18

3、-T2.1.3 主要仪器UV 754 紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；YXQ-LS-SH 全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；QYC 211 摇床：上海福玛实验设备有限公司；AL204 电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SHP-150型 生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；DZF-6050 真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HH-S28s 数显恒温水浴箱：上海精宏实验设备有限公司；超低温冰箱：上海精密科学仪器有限公司；台式高速离心机：上海化工机械厂；LG2020 电泳成像系统：河南兄弟仪器设备有限公司；全自动PCR仪：上海山富科学仪器有

4、限公司。2.2 实验方法2.2.1 试剂配制以下试剂配制均参考现代分子生物学实验技术(第二版)PDA苯胺蓝培养基：含苯胺蓝0.1g/L，琼脂20g/L。PDA愈创木酚培养基：含愈创木酚0.04%，琼脂20g/L。DEPC水：吸出1mL放在1000mL双蒸水中配成1DEPC水，放在1000mL容量瓶中静置24小时用于处理仪器，高压灭菌用于配置试剂。75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20保存(其中DEPC水需先高压)1MTris-Cl：121.14gTris-base溶于800mL水中，用冰乙酸调PH值至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌。0.5M EDTA：EDTA 186.1

5、g溶于800mL水中，用NaOH调PH值至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌。10mg·mL-1溴化乙锭：在10mL水中加入100mg溴化乙锭，溶解后分装成1mL小份，4保存。5XTBE：Tris-base 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH8.0)20mL，加水至1000mL。凝胶加样缓冲液：溴酚蓝0.4%，蔗糖60%。2.2.2 木质素降解酶的简单定性 PDA苯胺蓝平板退色试验1将试验菌接种于PDA苯胺蓝培养基平板，28下避光培养，记录蓝色培养基中有无退色现象的产生，有则记为+，反之记为-。+表示该菌株能产LiP和MnP。PDA愈创木酚平板显色试验2将试验菌接

6、种于PDA愈创木酚培养基平板上后，置28下培养，每天记录有无红棕色变色圈的产生，有红棕色圈者记为+ 反之记为-。+表示该菌株能产Lac。2.2.3 毛绒鬼伞（0901）菌丝体的培养、诱导及预处理用接种环挑一环试管种接入盛有25 ml PDA液体培养基的250 ml三角瓶，置恒温摇床中，28，240 rmin振荡培养约4 d，菌丝体足量后加入250ul 100 mmolL的2，5-二甲苯胺诱导漆酶基因的表达，24 h内收集菌体，用DEPC处理的dH O配制的PBS缓冲液清洗3次，滤干后迅速置于液氮中冻存10 min，备抽总RNA和总DNA3 总DNA、总RNA 的抽提和mRNA 的纯化 分别参见

7、TRIzol试剂和Oligotex mRNA Mini Kit操作手册42.2.5 基因组步行 具体操作步骤详见Clontech公司Universal GenomeWalkerT Kit User Manua12.2.6 SMARTTM RACE5SMARTTM 3'-RACE的原理 利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer，GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用

8、引物UPM(universal primer，UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。(见Figure 1)Figure 1.SMARTTM 5'-RACE 先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转

9、换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(见Figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer，GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。Figure 2.实验中发现，做RACE反应实验

10、实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为： 第一，在5'-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增)，每一步都可能导致失败；第二，扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。2.2.7 DNA的纯化。消化，连接和转化 见相应的试剂盒操作手册和文献6进行2.2.8 DNA测序3

11、 实验结果3.1 木质素降解酶简单定性结果试验菌各接种至愈创木酚平板和苯胺蓝平板当天即记录平板的变色现象，记录如下表1表1 木质素降解简单定性鉴定记录表培养基类型编号现象愈创木酚123苯胺蓝456注：+表示出现相应变色反应；记录时间为每隔24h。参考文献1 蔡磊,尹峻峰,杨丽萍,张克勤.几种简便的木质素降解真菌定性筛选方法.微生物通报，2002,29（1）：67-692 王宜磊,朱陶,邓振旭.愈创木酚法快速筛选漆酶产生菌.生物技术，2007,17(2):40-423 张银波,姜琼,江木兰,马立新.金针菇漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究.微生物学报,2004.12,44(6):775-7

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13、8 赵敏，宋小双，杨谦，等血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析【J中国生物化学与分子生物学报2004，20(6)181582011 宋小双，赵敏，刘桂丰。等北方梭囊孔菌漆酶基因DNA片段的克隆与序列分析J北京林业大学学报2005，27(5)：59-64(5 张银波，江木兰，胡小加，等灵芝(Ganoderma lucidum)漆酶基因的克隆及其序列分析J中国生物化学与分子生物学报2005，21(5)：700-7041 Soden dm，O callaan j，Dobson a dwMolecular cloning of a laccase isozym

14、e gene from Pleumtus sajor-cajuand expression in the heterologous Pichia pastorishost(JMicrobiology 2002，148(12) ：400340149 李剑凤，洪宇植，肖亚中栓菌420漆酶同工酶B基因克隆及异源表达J生物学杂志2007，24(3)：25-2814 Colao MCH，Garzillo AM，Buonocore VPrimary structure and transcription analysis of a laecaseencoding gene from the basidio

15、mycete Trarnetes trogli JAppl Mierobiol Bioteehno12003，63(2)：1531587 D souga TM，Boominathan K，Reddy c AIsolation of laccase genespecific sequences from white rot and brown rot fungi by PCRJApplEnvimnMicrobiol 1996，62(10)：3739-37441 任克宁,张福元.木质素酶及其生产菌株选育的研究进展. 畜牧与饲料,2010,(6):36-392 姜春燕, 等.木质素的研究进展. 山东

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