培养基验收作业指导书删减版

1、培养基质量控制作业指导书1、目的：为加强我微生物实验室的工作管理，保证实验室的检测质量，特制定此作 业指导书；2、范围：本规范适用于实验室微生物检测中所使用培养基的质量控制 。3、职责：3.1 检验人员：按照本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制，确保培养基符合相关标准的要求。3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。4、控制措施：4 1 培养基的购置和验收4.1.1 培养基的购置试剂管理员在接到批准的采购信息后，从合格供应商中选择厂商采购，同时要求厂商提供每批培养基的批号、使用前的 pH 值、储藏信息、有效期、性能评价记录（包括测试菌株、技术数据清单、质控证书及

2、必要的安全危害数据）。4.1.2 培养基的验收购买培养基到货后，由试剂管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。同时应 填写“培养基验收检查记录单” 验收符合要求后，交由检测人员接受保管，填写培养基入库记录和建立试剂台帐。4 2 培养基的储存干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在有效期或 6 个月内用完。应每月对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。 开封的脱水培养基，每次使用前应对其质

3、量进行检查，通过粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断培养基的质量变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。 即用性培养基按照产品标识要求进行储存。4 3 培养基的使用4.3.1 配制培养基用水和玻璃器皿培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Q cm的蒸储水或与其同质的水，每周检测电阻率，每三个月检测一次重金属离子含量。 制备培养基所用的玻璃器皿（如吸管、试管、烧杯等）新的玻璃器皿（首次使用）和再次使用的玻璃器皿按规定方法洗涤、干燥4.3.2 称量称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如房间环境湿度较大时，应提高称量速度，完毕后及时盖紧瓶盖

4、。4.3.3 复水复水时应注意以下事项：a）不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；b ）容器的大小需大于复水后培养基总体积的 2 倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；c）加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基；d）为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热；e）含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；f ）对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去；g）烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应

5、重新制备。4.3.4 灭菌培养基采用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌），通常是 121c 15min,含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须在15 分钟内灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。为避免高温破坏培养基的营养成分，降低琼脂的凝胶强度，必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复灭菌。4.3.5 pH 测定在初次使用每批培养基时，均需随同检测配制一个测试培养基，在灭菌或消毒后应在25温度下采用精密PH 试纸测试 PH 值，并判断是否符合要求；使用过程中，如果需要调整培养基的 pH,应用1mol/LNaOH或lmol/LHCL调整，注意不可反复调 pH

6、,否则会影响培养基的渗透压。4.3.6 配制好的培养基标识和保存灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。同时填写配制记录。内容：名称、配制量、配方（比）、操作中的重要参数（时间、压力、温度）、配制日期、配制者、截止使用日期。在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、配制日期、使用期限和配制人。培养基保存注意事项：1 ）环境条件：各种培养基均应在洁净的普通冰箱内保存，以 2-8 左右为宜，不得冻结。2 ）保存时限: 基础培养基应在30 天内用完。鉴别培养基应在21 天内用完。选择性分离鉴别培养基制成平板后当日用完 ,置保

7、鲜膜（袋 ）密闭保存期限可延长至一周。 从外单位购买的培养基保存时限按照产品标注的时限执行.4 4 培养基批号的的管理培养基的批号由 6 位阿拉伯数字组成，批号为年、月、日，各取2 位，年份取后 2 位，月和日不足 2 位时，分别在数字前加0，表明是本日配制的批号。如2004 年 6 月 4 日配制的培养基，批号为 040604 。4.5 质量检查购置的同一批次培养基其质量检查应能通过无菌检查（制备好的培养基经30-35c培养48小时，真菌培养基经2025c培养72小时候后，应无菌生长）、新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试， 经检查合格的该批次培养基方准许使用，否则不准使

8、用，做好检查记录。 成品培养培养基的质量控制应包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告4.5 培养基的性能测试新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告， 菌株的选择参考 SN/T 1538.2-2007 培养基制备指南第 2 部分：培养基性能测试实用指南。4 5 1 物理指标控制1） 测试20c25c的pH值2）琼脂层厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质；4 5 2 微生物污染的控制从每批制备好的培养基中选取至少一个

9、（或1%）平板或试管，置于35-37c或按特定标准中规定的温度培养48h应无菌生长，真菌培养基经2025c培养 72 小时候后，应无菌生长。4 5 3 微生物学指标控制可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法（详见表1- 表）对培养基性能进行测试，具体操作方法如下：（ 1）生长率将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。1）定量方法生长率Pr的计算：P R = Ns/NoNs：从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。No：从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应100cfu )要求：非选择性培养基上目标

10、菌的生长率最低应为0.7,该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1 ;每平板（或每试管）的接种水平为 10CF5 100CFU2）半定量方法半定量方法采用生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分的 总和即为生长指数 G, G值不应超过标准规定的允许范围。3） 定性方法定性方法采用划线法观察。选择性将浓度为104CFU/md 106CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培 养基和参考培养基中，培养基的选择性应达到规定值。定量方法选择因子Sf：S f = Do - D sDO:能在参考培养基上生长至少 10个菌落的最高稀释度DS:能在测试培养基上显示生

11、长的最高稀释度要求：非目标菌在选择性培养基上的Sf至少为2 ;半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制。生理生化特性（选择性和特异性）规定培养基的基本特性，使用一套适当的测试菌株对培养基上的目标菌的 生理生化特性（菌落形态、大小等）和非目标菌的被抑制程度进行测试。（2）性能评价和结果解释按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定，则该批培养基品质优 良；若只有物理指标和微生物指标符合规定，则该批培养基可被接收。表1计数用选择性培养基卬加昆用途培养釜 件测试菌株参英培控制 方法判定标 准特征反应Baird-Parker生长率37 c 2448h金黄色葡萄球 菌TSAalmPr 0.5黑色/灰

12、色菌落，周围为 一混浊带，其外有透明网ATCC6538/25923带卬加昆培养釜37 曲8h大肠5t国 ATCC25922/873参英培控制特征反应VRBG（结晶 紫中性大肠杆菌疑屋里37 c 2437 4824hAWW3 ATC(912228i-SA建粮PQ0.5黑色/灰色菌落，周围为 萤带区第鹿B 藉色或红色菌落鼠伤寒沙门菌,红胆盐 葡萄糖 琼MYpS牛长率30 c 24-月邮CC14028TSA人卜里Pr 0.7具沉淀带的粉色菌落48hATCC1菌78八L弋加上区邮催37 6 20hATCC29212/194ATCC25922磨修益酬鹿隼37 C 48h30 C 20h枯英麻地菌ATAC

13、CC6633；TSAalmPr0.5m麻做ft娜藤* LL* t. t-4- VRBL（紫红 胆汁乳糖）网9紫但困洛选择性30 C 20h粪链球菌ATCC29212/19433定性全部抑 制特异性30 C 20h铜绿假单胞菌ATCC27853定性-无色至浅棕色菌落CT-SMA（改良 山梨醇 麦康凯 琼脂）网、生长率37 C 24h大肠杆菌O157: H7 ATCC43894/438 95,TSAalmPr0.5透明菌落，表面淡黄棕色，菌落直径约1mm选择性37 C 24h金黄色葡萄球 菌ATCC6538/25923定性全部抑 制特异性37 C 24h大肠杆菌ATCC11775/259定性粉色菌

14、落22BGBLB（煌绿 乳糖胆盐肉 汤）L生长率30 c 2448h大肠杆菌ATCC25922/8739TSA半定 量浊度2+,导 管1/3 产气产气并浑浊弗氏柠檬酸杆 菌ATCC25922/8739选择性粪链球菌ATCC29212/19433定性不生长EC L生长率44 c24 48h大肠杆菌ATCC25922半定 量浊度 2+,导 气管1/3 产气产气并浑浊选择性44 c24 48h铜绿假单胞菌 b ATCC27853定性不生长EC-MUG LS-MUG L/生长率44 c24 48h大肠杆菌ATCC25922半定 量浊度2+,导 气管1/3 产气产气并浑浊，产生荧光选择性44 c24 4

15、8h铜绿假单胞菌ATCC27853定性不生长乳糖胆盐发酹L生长率37 C 24h大肠杆菌ATCC25922半定 量导气管1/3产气产气并变黄色选择性37 C 24h鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性不产气、仍为紫色LST （月 桂酸肉 汤）L生长率37 C 24h大肠杆菌ATCC25922半定 量导气管1/3产气选择性37 C 24h福氏志贺氏菌CMCC51572定性表2计数用非选择性培养基基用途培养条 件测试菌株经与 培控制方法判定标 准特征反应PCA（平 板计 数琼 脂）网生长 率30 c72h大肠杆菌ATCC25922/8 739 金黄色葡萄 球菌ATCC6538TSA里Pr 0.7枯草

16、芽抱杆菌 ATCC6633表3选择性增菌培养基基用途培养条 件测试菌株控制方 法判定标准特征反应EE L生长率37 c24h大肠杆菌ATCC25922/8739牛Ah里VRBGh 10CFU粉红至红色 菌落，有或 没有沉淀带鼠伤寒沙门菌 ATCC14028选择性粪肠球菌ATCC29212全部抑制RVS L生长率41.5 C 24h鼠伤寒沙门菌 ATCC14028牛Ah里XLD或其他 选择性培 芥基上 10CFU肠炎沙门氏菌 ATCC13076铜绿假单胞菌 ATCC27853选择性41.5 C 24h大肠杆菌ATCC25922里TSA上全抑制粪链球菌ATCC29212TSA上 V 10CFUSC

17、（亚 硒酸 盐胱 氨酸）L生长率37 c 24h鼠伤寒沙门菌 ATCC14028牛Ah里XLD或其他 选择性培 芥基上 10CFU不同培养基 上菌落特征 不同（见标 准）+大肠杆菌ATCC25922+铜绿假单胞 菌ATCC27853选择性37 c24h大肠杆菌ATCC25922牛Ah里TSA上 V 10CFU粪链球菌ATCC29212TTB（ 四硫 磺酸 钠煌 绿增 菌液） L生长率37 c24h鼠伤寒沙门菌 ATCC14028牛Ah里XLD或其他 选择性培 芥基上 10CFU不同培养基 上菌落特征 不同（见标 准）伤寒沙门菌CMCC50071选择性37 c 24h大肠杆菌ATCC25922T

18、SA上 V 10CFU碱性 蛋白生长率37 c 24h霍乱弧菌CMCC16109牛Ah里TCBSe 具 他选择性不同培养基 上菌落特征月东水L副溶血性弧菌 CMCC20001卬笠昆10CFU不同（见标 准）选择性37 c24h大肠杆菌ATCC25922/8739福氏志贺氏 菌 CMCC51572TSA上 V 10CFU7.5% 氯化 钠肉 汤L生长率37 c24h金黄色葡萄 球菌ATCC6538牛Ah里B-P平板或 其他籍亦 基上 10CFU不同培养基 上菌落特征 不同（见标 准）表4 非选择性增菌培养基卬加昆用途培养釜 件测试菌株控制方 法判定标准特征反应BHI生长 率37 c 24h金黄色

19、葡萄球菌 ATCC6538定性浊度12蛋白陈 盐 L稀释2025 C 45min大肠杆菌ATCC25922Ab里+/-50%菌落 数/至（+/- 50%M始菌落 数金黄色葡萄球菌 ATCC25923表4非选择性增菌培养基（续）卬加昆用途培养釜 件测试菌株控制方 法判定标准特征反应乳糖蛋 白月东肉 汤 L生长 率37 c 24h大肠杆菌ATCC25922定性导气管1/3产气选择 性37 c 24h鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性SCDLP液体培L生长 率37 c 24h铜绿假单胞菌 ATCC27853 大肠杆菌ATCC25922 金黄色葡萄球 菌 ATCC6538定性浊度12液体沙 氏培养 基

20、L生长 率26 c 5 天白色念珠菌CMCC98001定性浊度12真菌培L生长 率26 c 5 天白色念珠菌CMCC98001定性浊度12表5选择性分离培养基卬加昆用途培养釜 件测试菌株控制方 法判定标准特征反应亚硫酸 酸轮琼 脂网生长率37 c 48h鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长(2)菌落呈黑色，有 金属光泽福氏志贺氏菌CMCC51572菌落呈棕色选择性大肠杆菌ATCC25922/8739全部或部 分抑制 (0-1)无典型菌落粪链球菌ATCC29212/19433全部抑制 (0)-XLD 网生长率37 c 24h鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长(2)菌落呈黑色福氏志贺

21、氏菌CMCC51573菌落呈无色选择性大肠杆菌ATCC25922/8739全部或部 分抑制 (0-1)无典型菌落粪链球菌ATCC29212/19433全部抑制 (0)-血琼脂 平板 网生长率37 c24 48h金黄色葡萄球 菌ATCC6538/25923定性良好生长B溶血，透明溶 血环粪链球菌ATCC29212定性良好生长a溶血，草绿色溶 血环TCBS 网生长率37 c24 48h霍乱弧菌CMCC16109定性良好生长菌落较大，呈黄 色副溶血性弧菌CMCC20001定性良好生长菌落较大，呈绿 色4号琼 脂 S生长率37 c24 48h霍乱弧菌CMCC16109定性良好生长菌落较大、扁平 透明、湿润、中 心带有黑色非O1群霍乱弧菌 CMCC17045定性良好生长菌落较大、扁平 透明、湿润、中 心带有黑色选择性37 c 24h大肠杆菌ATCC25922/8739定性全部或部 分抑制 (0 1)表5 选择性分离培养基(续)卬加昆用途培养釜 件测试菌株控制方 法判定标 准特征反应伊红美 兰琼脂 网生长率37 c 24h大肠杆菌ATCC25922/8739定性良好生 长菌落紫黑色带金属 光泽鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生 长菌落灰白色半透明福氏志贺氏菌CMCC51573定性良好生 长