生物化学教案-第十章蛋白质的生物合成-2学时

1、授课题目（章、节或主题）：一章蛋白质的生物合成课时安排2授课时间第10周授课类型（请打，）理论课口，研讨课口习题课口复习课口其他口授课方法（请打，）讲授口，讨论口示教口自学辅导口其他口授课资源（请打，）多媒体口，模型口实物口挂图口其他口教学目的：1、掌握蛋白质生成的过程、所需酶。2、了解蛋白质生物合成与医学的关系。3、了解分子生物学常用技术。教学方法、手段：板书、多媒体技术辅助教学教学重点、难点：重点：蛋白质生成的过程、所需酶。难点：分子生物学常用技术教学内容及过程设计补充内容和 时间分配一、课程回顾：（和同学们互动，以提问的方式回忆上节课所讲内容并板书）1 .DNA复制过程中有哪些酶和因子参

2、与，各自如何发挥作用？2 .简要说明复制的特点，参与复制过程的几大类物质及其作用。二、讲授新课：蛋白质的生物合成（翻译）蛋白质的生物合成，即翻译，就是将核酸中由 4种核甘酸序列编码的 遗传信息，通过遗传密码破译的方式解读为蛋白质一级结构中20种氨基酸的序列。一、蛋白质生物合成的原料和所需酶类（一）合成原料1 .三种RNA2 . 20种编码氨基酸作为原料。3 .酶及众多蛋白因子，如 IF、eIF o4 . ATP、GTP无机离子。（二）酶及蛋白因子1 .氨基酰-tRNA合成酶ATP 存在下合成氨基酰-tRNA,具有绝对特异性。2 .转肽酶催化核糖体“ P位”上的肽酰基转移至“ A位”的氨基酰-t

3、RNA的氨基上，（10分钟） 课程回顾（5分钟） 蛋白质生物 合成的原料 和所需酶类使酰基与氨基缩合形成肽键。3 .转位酶催化核糖体向mRNA勺3'端移动定位于“ A位”。4 .蛋白因子起始因子(initiation factor,IF);延长因子(elongation factor,EF);释放因子(releasing factor,RF)。5 .能量物质及离子(5分钟)mRNAf遗传密码能量物质为ATP和GTP无机离子有M4和K+等。二、mRNAf遗传密码(一)顺反子(cistron)1 .遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子。2 .原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，

4、转录生成的mRNAU"编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子(polycistron) 。3 .真核mRNAR编码一种蛋白质，为单顺反子(single cistron) 。(二)遗传密码及其特点1 .连续性(commaless)(1)mRNA分子上从5至3方向，由AUGFF始，每3个核甘酸为一组， 决定肽链上 某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码(tripletcoden)。(2)起始密码(initiation coden): AUG (3)终止密码(termination coden)(4)从mRNA5端起始密码子 AUG!U 3端终止密码子之间的核甘酸序列，各个

5、三联 体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架(open readingframe, ORF)。2 .简并性(degeneracy) 遗传密码中，除色氨酸和蛋氨酸仅有一个密码子 外，其余氨基酸均有多个密码子。3 .方向性(direction)起始密码子位于 mRNAO5'-端，终止密码子位于 3'-端，翻译时沿5' 一 3' 方向进行，直到终止密码子为止，相应多肽链的合成从N端向C端延伸。4 .通用性(universal)(1)整套密码从原核生物到人类都通用，但动物细胞的线粒体、植物细胞的叶 绿体例外。(2)密码的通用性证明各种生物进化自同一祖先。5

6、.摆动性(wobble)转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNAh的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。三、rRNA与核糖体(一)核糖体由大、小两个亚基组成，是蛋白质合成的场所。(二)原核生物翻译过程中核糖体结构模式1. P位：肽酰位，又称给位。2. A位：氨基酰位，又称受位。3. E位：排出位。四、tRNA与氨基酸的活化（一）氨基酸的活化4. 氨基酰-tRNA合成5. 氨基酰-tRNA合成酶对氨基酸和tRNA特异性高；具有校正活性。氨基酰-tRNA 的表示方法：Ala-tRNAAla、Ser-tRNASer、Met-tRNAMet（

7、二）起始肽链合成的氨基酰-tRNA真核生物：Met-tRNA iMet（15分钟）原核生物：fMet-tRNA 1fMet蛋白质生物五、 蛋白质生物合成过程合成过程翻译过程从阅读框架的5'-AUG开始，按mRNAI板三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。）起始指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物（translational initiation complex）。1 .核糖体大小亚基分离；2 . mRNA在小亚基定位结合；3 .起始氨基酰-tRNA的结合；4 .核糖体大亚基结合。）延长肽链延长包括进位、成肽、转位三步，在核糖体上连续性循环式进行，

8、又称为核糖体循环（ribosomal cycle）,每次循环增加一个氨基酸。1 .进位（注册 ,registration）（1） fMet-tRNAfMet 占据 P位，A 位空缺。（2） 第2个密码子相应的氨基酰 -tRNA与EF-Tu-GTP结合，其反密码子识 别密码子，进入 A位。（3） EF-Tu水解GTP EF-Tu和GDPR核糖体释出，重新形成 Tu-Ts二聚体。2 .成肽是由转肽酶（transpeptidase） 催化的肽键形成过程。3.转位延长因子EF-G有转位酶活性，可结合并水解1分子GTP促进核蛋白体向 mRNA的3'侧移动 。（三）终止1 .当mRNAb终止密码出

9、现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA核糖体等分离的过程。2 .识别终止密码，RF-1特异识别UAA UAG而RF-2可识别UAA UGA3 .诱导改变转肽酶的酯酶活性为水解活性，使肽链从核糖体上释放。六、蛋白质生物合成与医学（5分钟）蛋白质生物合成与医学（30分钟） 基因工程与 分子生物学 常用技术（一）分由于基因突变导致蛋白质一级结构的改变，进而引起生物体某些结构和 功能的异常，这种疾病称为分子病。分子病最典型的代表为镰刀型红细胞贫血 病。（二）抗生素对蛋白质合成的影响1 .抗生素类是微生物产生的能够杀灭或抑制细菌的一类药物。第四节基因工程与分子生物学常用技术分子生物学

10、技术现已广泛渗透到生命科学和医学等多个学科中，尤其推动了基因工程的发展。对疾病的发病机制、诊断及药物生产等领域取得了令人瞩目的成就，对医 学的发展起着巨大的推动作用。、基因工程与基因重组DNA重组：不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的 DNA分子，称为DNA1组。基因工程：将基因进行克隆，并表达制备特定的产物，或定向改造细胞乃 至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。、重组DNA技术的基本原理和过程基因工程中最主要是分子克隆，克隆是指由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所采用的技术即重组DNA技术，故又称为分子克隆技术或基因工程技术。（一）目

11、的基因的制备1 .制备基因组 DNA文库（genomic library）将基因组DNA1切成片段，再与载体分子拼接成重组DNA将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆混合体称基因组文库。2 .制备 cDNAC库（cDNA library）将mRN砸转录合成cDNA,再与载体连接成重组 DNA将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混合体称为cDNAC库。3 .聚合酶链式反应（PCR）如已知目的基因序列，则可采用PCR从基因组DNA中获得目的基因，也可以采用逆转录 PCR （RT-PCR）直接从mRN颂得特定基因的 cDNA4 .化学合成如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应密码子推导出DNA的碱

12、基序列，然后合成该段DN际列。（二）目的基因与载体的连接将目的基因插入载体，用 DNA!接酶连接双链 DNA占性末端序列，在 体外重新连接成人工重组体。方法主要有以下四种：1 .粘性末端连接2 .同聚物加尾连接3 .平末端连接4 .人工接头连接（三）将外源DNA导入宿主细胞常用的方法有以下两种：1 .转化(transformation)转化是指将质粒或其他外源DNAI入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。2 .感染(infection)感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。3 四)目的基因的筛选和鉴定1 .遗传学方法针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基因(a

13、mpK tetr 、kanr等)和目的基因而设计的筛选方法。2 .分子杂交方法利用32P标记的探针与重组 DNA克隆DNA片段进行分子杂交，直 接筛选并鉴定目的基因。3 .免疫学方法利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛选。(五)克隆基因的表达利用重组DNA技术所获得目的基因或 DNA序列，可实现在受体细胞中的表达， 即产生mRN域蛋白质产物。(六)重组DN破术操作过程总结归纳、核酸分子杂交技术核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )是指利用DNAM性原理，把不同来源的DNA单链或DNA与RNA混合，如单链分子间有碱基配对关系，则可形成杂化双链的过程。

14、(一)探针(probe)1 .探针是一段与被测的核甘酸序列(靶基因序列)互补的带有标记的核甘酸片段。2 .理想探针的特点(1) 带有标记的示踪物，便于检测、鉴定；(2) 应是单链；(3) 具有高度特异性；(4) 探针长度一般为数十至数千个碱基；(5) 具有高灵敏度和稳定性，标记方法简便安全。(二)核酸分子杂交的基本方法1 . Southern印迹杂交(1) 指将经酶切和电泳分离的待测DNA片段转印到固相支持物上，然后与标记的DN琳针杂交。(2) 可用于分子克隆、遗传病诊断、法医鉴定、肿瘤研究和器官移植等方面。2 . Northern 印迹杂交（1） 指将经电泳分离后的待测RNA段转印到固相支持

15、物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。（2） 主要用于检测各种基因转录产物，主要是mRNA3 .斑点及狭缝印迹杂交（1） 指将RNA DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，称为狭缝印迹杂交。（2） 主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。4 .原位杂交（1） 指将标记的核酸探针与经适当方法处理的细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。（2） 该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。四、聚合酶链反应（一）PCR的基本原理（二）P

16、CR的基本反应PCR反应体系：1 .引物 是PCR寺异性反应的关键， 取决于引物与模板 DNA互补的程度。2 . 酶浓度 酶催化的PC或应的Taq DNA聚合酶量约需2.5U。3 . dNTP 的质量 dNTP的质量与浓度和 PCRT增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当，易变性失去生物学活性。4 .模板核酸模板核酸的量与纯化程度是 PC做败与否的关键环节之一。（三）PCR的应用1 .可分析基因转录产物；构建 cDNA文库；克隆特异 cDNA合成cDNAW针。2 .可判断突变的基因片段，如癌基因和抑癌基因中点突变的检测和鉴定。3 .用于病原微生物的微量检测及鉴别菌株；突变基因的筛选；法医学鉴定；DNA序列分析；器官移植配型等。4 .应用于遗传性疾病的诊断如地中海贫血、苯丙酮酸尿症等；感染性疾病如肝炎、结核等诊断。5 .根据已知致癌基因顺序设计特异的模板和引物，用于筛选特异的抗肿瘤化合物。（10分钟）本次课程小结：课程小结1、蛋白质生物合成（翻译）的过程（重点）2、基因工程和分子