基因工程原理复习重点

1、1 .基因家族(Gene family)又叫多基因家族(Multigene family ),系指同一生物体中，从同一祖先基因经过复制、突变 而来的一组具有相似的核甘酸序列结构、相似产物、相似功能的基因群体。从广义上讲，同一基 因家族的各个成员也可看作是重复基因。但两者相比，基因家族不同成员之间的序列差异毕竟要比重复序列的大一些，也就是说序列一致性程度还是较低一些。2 .基因簇(Gene cluster)系指原核生物基因组中，由不同的或相关的一组相邻基因组成的一种特殊的排列组合方式。3 .基因家族与基因簇二者的区别属于同一多基因家族的各个成员，可以存在于不同的染色体上，也可以是存在于同一条染色

2、 体上。同一基因家族成员的判断标准：a.多重性；b.紧密的连锁性；c.核甘酸序列同源性；d.相关的表型与功能。基因簇的特点：a.同一基因簇的不同成员，在遗传上往往是紧密连锁的；b.同一基因簇的不同成员，可以是同属于同一个操纵子的不同结构基因，也可以是属于不同操纵子的不同结构基因。c.同一基因簇的不同成员，可以是来自同一基因家族的不同成员，也可以是来自不同基因家族的不同成员。4 .基因图(Gene map):是描述染色体或 DNA大分子上，不同基因的排列顺序及其间隔距离的 一种线性图。5 .基因作图(Gene mapping):按照遗传学的方法或者是物理学的方法绘制基因图的过程，叫做基因作图。基

3、因作图有时也叫做基因定位。它涉及如下两个具体的内容：a.其一是确定被研究的目的基因与细胞染色体之间的关系，也就是说将目的基因定位在某条特定的染色体分子上。b.其二是测定目的基因与所在染色体的其它基因之间的间隔距离，以及它们之间的线性排列顺序，亦即是确定目的基因在染色体上的位置。基因图包括遗传图和物理图两种。两者之间的本质差别在于前者表示的是以重组率为单位的基因间的相对距离，而后者表示的是以碱基对(bp)为单位的基因间的实际距离。6 .基因增加(Gene addition)：与基因扩增概念不同，它是通过将一种或一群外源基因导入受体细 胞，从而使受体细胞中基因种类增加，用以观察并研究其功能作用的一

4、种基因工程策略。7 .基因扩增(Gene amplification):特指基因拷贝数增加的过程，包括如下5种不同情况：在体外，应用 PCR技术和适当的引物，可使特定基因的拷贝数得到成功的扩增。克隆， 将基因插入到高拷贝数的质粒分子上，于是在体内情况下该基因的拷贝数也变的相应富裕起来。一些外界环境的压力因素可以使真核细胞产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因发生明显扩增。例如，高剂量的氨甲喋吟可导致二氨叶酸还原酶基因发生扩增。程序基因扩增。包括全 基因组扩增和选择性扩增两种模式。前者是指通过增加细胞基因组的拷贝数，而使特定基因的拷贝数得以增加；后者是指因特定发育需要而偶尔增加对其产物需求量高的

5、基因的拷贝数。例如，非洲爪蟾在发育过程中 rRNA基因的扩增。进化扩增，在生物进化过程中发生基因加倍和扩增， 结果使相关的基因在基因组上聚集成簇。8 . 5'-侧翼序列区和3'-侧翼序列区(1) 5'- 侧翼序列区( 5'-flanking sequence region)位于 mRNA 转录起点之前的一段长度有限的 DNA 序列区， 叫做 5'-侧翼序列区， 或者泛称为启动子区。在该区存在着数种控制基因转录的信号：a. 确定mRNA 起点的信号b. 决定最大转录起始速率的信号c. 对环境刺激作出反应的信号d. 对发育程序作出反应的信号e. 增强子序列区

6、(2) 3'- 侧翼序列区( 3'-flanking sequence region)位于 mRNA 转录终点之后的一段长度有限的 DNA 序列区，叫做3'-侧翼序列区，也叫做3'-下游序列区。在该区存在着数种控制基因转录的信号：a. 终止转录作用的信号b. mRNA3'- 末端的加工信号c. 大多数真核基因的3'-末端还有一段poly(A) 加尾信号，即多聚腺苷酸化信号9 .前导序列区和尾随序列区(1) 前导序列区(leader sequence region)指位于 mRNA 5'-末端，起始密码子之前的一段长达数百个核苷酸的不转译的

7、 RNA 区段，也叫前导序列或5'-非转译区，简称5'-UTR 。它含有如下两种元件：a. 核糖体结合位点(Ribosome-binding site ,RBS)b. 转译起始信号(2)尾随序列区(trailer sequence region)指位于 mRNA 3'- 末端，终止密码子之后的一段非转译的核苷酸序列，叫做尾随序列区，也叫做尾随序列或3'-非转译区，简称3'-UTR ，其长度约为 100 个核苷酸左右，它含有一个转录终止信号。10 . 真核基因和原核基因真核基因：真核细胞核基因组 DNA 编码的基因，以及感染真核细胞的 DNA 病毒和反转录

8、病毒基因组编码基因，统称真核基因。原核基因：由原核生物染色体基因组 DNA 以及高等生物线粒体基因组DNA 和叶绿体基因组 DNA 编码的基因，都属于原核基因。 11.真核基因与原核基因的共有组成部分无论真核基因还是原核基因，其结构都有如下4 个部分：a. 编码区( coding region )b. 非编码区( noncoding region)c. 启动区 (promoter region ) d. 终止区 (terminator region)1. 编码区( 1)编码区的含义：在原核蛋白质编码基因的 mRNA 分子中，以及在真核蛋白质编码基因的成熟 mRNA 分子中，从起始密码子(通常是

9、AUG) 开始至终止密码子( UAA,UAG ,UGA) 为止的一段编码氨基酸的核苷酸序列，叫做编码区，或称编码序列区。( 2) 不连续的编码序列区：真核基因结构的主要特征是， 许多真核蛋白质编码基因以及某些tRNA基因，它们的转录序列区都是被一种叫做间隔子( intron) 的非编码序列所间断，形成不连续的编码序列区。3）编码区段与读码框：编码区与开放读码框（open reading fram）在概念上是有差别的。开放读码框（ ORF）也有的 叫可读框， 是指由一系列氨基酸密码子组成的不具有终止密码子的 DNA 序列区， 或者说是可以 转译成蛋白质多肽链的一段DNA 序列区。它与编码区的差别

10、在于它不包括终止密码子，而编码区则包括终止密码子。2. 非编码区（ 1） 非编码区的定义： 基因中转录而不转译的核苷酸序列区。 尽管这些非编码序列区不转译成 蛋白质多肽链产物，但对基因的表达与调控却是必不可少的。（ 2）非编码区的类型a. 5'-末端非转译区（5'-UTR）b. 3'-末端非转译区 （3'-UTR）c. 间隔子序列区（真核蛋白质编码基因中存在）3. 启动区（启动子）（ 1 ）启动区的定义：相应于原核的启动区（promoter ）在真核基因中则往往译作启动子，特指位于基因5 '-末端上游紧邻转录起点外侧，一段具有特殊功能的非编码的核甘酸序列

11、区。在有 关的文献中，启动区的定义似乎不那么严格，有时人们也把5'-侧翼序列区泛称为启动区。从广义的角度讲，控制基因转录的各种信号的任何组合都可以称之为启动区。例如有人也把增强子（enhancer）归为真核基因启动子的一个组成元件.（2） 启动区的结构原核基因启动区的结构：a. 1 0 元件，亦叫1 0 box 或 Pribnow box ,也可称之为 TATAAT box ;b. 3 5 元件，也叫做3 5box,或TTGACA box。真核基因启动子的结构：a. 2 5元件，亦叫TAT A盒；b.上游激活元件：G C box和C A A Tbox。（3）启动区的类型：根据识别启动子

12、的RNA聚合酶的类别，可将真核启动子分成三种不同的类型：a. I型启动子b. n型启动子c.ni型启动子4.终止区（1）终止区的定义：（terminator region ）也叫做终止序列，一般特指位于原核生物操纵子3 '-末端，也是转录单位3 /-末端转录终止位点之后的一段DN A序列，其功能是为RN A聚合酶提供转录终止信号。终止子（terminator）,也叫做转录终止子或终止序列，是指位于真核基因3 /-末端下游外侧与转录终止位点相连的一段非编码的核甘酸序列区。它具有使RNA转录反应终止的转录终止信号的功能。（ 2）终止区的意义（功能） ：a.保证基因的转录反应在正确的位置终止

13、；b.产生正确长度的m RN A分子；c. 产生正确的蛋白质多肽链； d. 避免产生通读现象。12. 原核基因组的结构（ 1 ）大肠杆菌基因组的组成：染色体基因组；质粒基因组；噬菌体基因组。（2）大肠杆菌基因组的结构特点（有 4 点） ：* 1.高效的遗传信息利用率a. 既没有不必要的额外重复序列，也极少存在无功能的冗余序列；b.基因组9 8 %以上的核甘酸序列都是编码基因c.基因排列紧凑，同一个操纵子不同基因之间的间隔距离一般不超过2 0 bp,而且其中还存在着转录起始信号和终止信号；d. 存在着编码序列彼此重叠、编码不同蛋白质的重叠基因*2.双链DN A的编码功能关于正义链和反义链的划分，

14、文献中有两种不同的意见：早期文献：a.转录RNA转录本的模板链，叫做正义链，也叫做有义链或编码链，简称（十 ）链。b.与正义链互补的DNA链，叫做反义链，也叫无义链或非编码链，简称（）链。现在的文献：a.双链DNA分子中转录RNA转录本的模板链，叫做反义链或非编码链，简称（）链。b.双链DNA分子中模板链的互补链，叫做编码链，又叫正义链，简称（十 ）链。除了以U取代T之外，它与RNA转录本具有同样的核甘酸序列结构。E.coli基因的编码序列，并非都是位于基因组DNA中某一条固定的单链上。也就是说基因组DNA的两条链，并没有规定哪一条是正义链，哪一条是反义链。而是在双链DNA（基因组）的任何一条

15、单链中，都同时存在着正义链和反义链 。对基因组是如此，但对单个基因则不然。*3. 多基因聚集排列的操纵子结构形式大肠杆菌基因组结构的另一个特点是，若干功能相关的基因往往聚集在一起形成独立的操纵子结构。 操纵子的一般结构：a. 一个或数个调节基因 b. 若干个结构基因， 小的操纵子只有三个基因。 大的操纵子有11 个结构基因。 c. 上游控制单元，包括操纵单元和启动区。*4. 染色体基因组的拷贝数大肠杆菌染色体基因组的拷贝数，也就是说究竟一个细胞同时能拥有几条染色体。这是依细菌的生长条件而定：a.在营养富裕的培养基中，每个细胞可同时拥有34条染色体分子。b. 在碳源供应不足的培养基中，平均每个细

16、胞只拥有1.1 条染色体13. 原核基因的结构：*1.原核基因D N A序列的结构：a. 启动区序列；b.转录序列区：（5' -UTR; cDNA序列区一编码区；3'-UTR）;c. : 终止序列区*2.原核基因mRNA的结构：（a）启动区（b）转录序列区： 5 ' -UTR编码区，包括起始密码子和终止密码子；3 ' -UTR（ c）终止区14. 真核基因的特点：（ 1）与原核基因不同，真核基因往往含有内含子（ intron ） ，它是被包围在编码区之中 的非编码序列； （ 2）真核基因是单顺反子，编码单基因产物，而原核基因则往往组成大的转录单位多顺 反子，即单

17、一的 mRN粉子可编码多种基因产物；（3）成熟的蛋白质基因的 mRN/子的5'-端有一个帽的结构，3'-端有一个Poly （A） 尾巴。15. 真核基因组的结构特点：* 1.包装成特定的染色体结构；真核基因组DNA是裸露的，而是被包装成若干条甚至数十条不同的染色体，这是真核基因组的一大特点。* 2. 基因组的多倍性； 大多数真核生物都是二倍体，具有两套分别来自双亲的完整的基因组。而且有些高等植物还是多倍体，拥有多拷贝的基因组。* 3.具有大量的重复序列；重复序列的类型：低度，中度，高度重复序列的排列方式：串联重复排列分散重复排列* 4.高比例的非编码的DNA歹U;在真核生物基因

18、组 DNA中含有大量的非编码的DNA歹U,包括基因与基因之间的非编码的DNA序列，以及基因内部的非编码的DNA序列。以人为例，非编码序列占基因组总长的98%以上，而蛋白质编码基因的序列还不到基因组总长的2%。* 5. 庞大的基因数量； 拟南芥 25， 000 种左右，水稻40， 000 种左右，人类24 ， 000 个左右。16. 隐蔽基因定义：位于基因组蛋白质编码基因之间的非编码的DN附列中，只编码 RNA编码蛋白质的一类 RNA基因，叫做隐蔽基因。17. 断裂基因：在转录区的核甘酸序列区中，插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔序列区，使一个基因的编码序列分隔成若干个不连续区段的基因， 叫做断

19、裂基因， 包括内含子（ intron ） 和外显子 （ exon ） 。18. 真核基因的结构（1）真核基因DNA序列水平的结构：a.启动子序列区b.转录序列区c.终止子序列区（ 2）真核基因pre-mRNA 的结构：a. 5 -UTR b. 外显子c. 内含子 d. 3' -UTR序列（3）真核基因成熟 mRNA勺结构（五部分）：真核蛋白质 mRNA前体（pre-mRNA）经过剪辑加工（去掉间隔子、加帽和加尾）成熟后， 被输送到细胞质。a. 5 - 帽的结构b. 5 -UTR 序列 c. 编码序列d. 3' -UTR序列 e. 3'-端 poly （A）尾巴19. 增

20、强子（ enhancer ）又叫做增强子元件或增强子序列，是真核基因中发现的一种特异序列，能够在距离目标基因50kb 以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。一般是位于真核基因 5 - 侧翼序列区，但也有的是位于转录区和3 - 侧翼序列区。增强子的功能作用： 成环作用；增强子可影响模板附近的DNA超螺旋的密度（结构），诸如导致DNA超螺旋弯曲，或是在反式作用因子参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介，使增强子和启动子之间的DNA“成环”的连接模式起始转录。 固定作用将模板固定在细胞内特定位置，如连接在核基质上，有利于拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构张力，有利于促进 RN咪合酶

21、在DNA链上的结合与滑动。引导作用可以为反式因子或RNAM合酶II提供进入染色体结构的“进入位点”。20. 基因的分类（1）按拷贝数分：单拷贝基因， 多拷贝基因（2）按产物类型分：结构基因，调节基因（3）按表达特性分：组成基因，诱导基因（4）按实验用途分：选择基因，报告基因（5）按排列组合特点分：基因家族，基因簇选择基因： 指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具有的新的遗传特征， 从而使得人们能够使用特定的选择培养基，将转化的新细胞（即转化子），从其亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。报告基因： 特指其编码产物能被快速检测，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞、器官或组织的一类特殊

22、基因。21. 基因工程诞生的理论基础（1）20 世纪 40 年代确定了遗传信息的携带者 （分子载体 ）是 DNA 而不是蛋白质。（2）20 世纪50 年代的双螺旋结构模型与半保留复制机理（3）20 世纪50 末 60 初，科技工作者提出中心法则和操纵子学说，遗传密码的破译，阐明了信息流的方向。22. 基因工程诞生的技术基础（1）核酸内切限制酶， DNA 的体外切割与连接， DAN 连接酶； （2）DNA 核苷酸测序技术；（ 3）基因克隆载体的发展与应用；（ 4）大肠杆菌遗传转化技术的建立；（ 5）琼脂糖凝胶电泳技术应用；（ 6）核酸杂交技术的应用。23. 酶的分类 : 氧化还原酶类，转移酶类，

23、水解酶类，异构酶类，裂解酶类，连接酶类。24. 共线性的概念（ 1）位于同一条染色体DNA 或 DNA 分子上不同基因的位置排列关系；（ 2）不同物种中DNA 的排列关系；（ 3）位于DNA 分子及其转录本RNA 分子间的共线性；（ 4） mRNA 密码的顺序与蛋白质氨基酸顺序。25. 切口 （ Nick ） ： 在双链 DNA 的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。裂口（ Gap）:指双链DNA分子的某一条链上，失去一个或连续几个核甘酸时所出现的DNA单链断裂。 DNA 连接酶无法封闭裂口。26. 核算内切限制酶： 是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸

24、序列， 并由此切割 DNA双链结构的核酸内切酶。（1）与i型、n型不同，不具备多亚基的结构，可在没有修饰的情况下切割;（ 2）识别双链DNA 分子的限制位点；（ 3）切割位点发生两条链切割，形成互补黏性末端；（ 4）酶切反应不需要能量；（ 5）因两个单链切割部位是交错的，黏性末端互补。28.影响核酸内切限制酶活性的因素（ 1） DNA 的分子特性a 识别位点周围核苷酸碱基成分可影响其底物 DNA 消化的速率，有时达25倍；b 特定 DNA 分子中所具有的目标限制位点的密度；c 完全超螺旋 DNA 分子比线性DNA 分子消化时需要更多的酶；d DNA 分子的甲基化程度，如果位点发生甲基化，会强烈

25、干扰核酸内切限制酶的活性。（ 2）酶切消化反应的温度，大多最适温度为37。（ 3） DNA 制剂的纯度对酶切活性的影响，制剂中的污染物：酚，氯仿，蛋白质，酒精，甘油，高盐， SDS, EDTA 等；29. 星号活性： 在反应条件发生变更的情况下，核酸内切限制酶便失去了切割其固有识别序列的能力， 而会在新的识别序列上发生DNA 分子切割。 这种发生了改变的限制酶活性， 叫做星号 （ * ）活性，或限制酶星号活性。产生星号活力的原因：（1）酶用量的单位数与 DNA用量的比值过高，超过 10U/g; （2）甘油 浓度不可超过5%; （3）二价离子Mg2+被Mn2+、Cu2+Zn2+Ca2+取代；（4

26、） Mg2+浓度低于25mmol/L（ 5） Buffer pH 不能高于 8； （ 6 ）有机溶剂的干扰。30. DNA 分子体外连接条件（ 1）一条DNA 链 3端存在游离的3 -OH（ 2）一条DNA 链 5端存在游离的5 -磷酸基团（ 3）连接体系需要能量ATP31. 碱性磷酸酶的类型： a 细菌碱性磷酸酶（ BAP ） b 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）32. 平末端 DNA 片段连接的方法（ 1） T4 DNA 连接酶连接法（2）同聚物加尾法（ 3）限制片段末端修饰法（ 4）衔接物连接法（ 5） DNA 接头连接法33. T 载体结构上有哪些优点？（1） T载体是一种线性双链 DNA

27、,不需切割，即可扩增PCR产物；（2）3' T单核甘酸延伸末端，可直接与PCR产物具有3'小单核甘酸延伸的分子进行碱基互补；（3）线性载体已经脱去 5'干，自己不会再环化；（4） T载体中设计了 Lac Z基因，可通过显色反应X -gal显色反应分离重组体；（ 5）在T 载体的 3 末端附近还设计了多个核苷酸酶切位点，便于进行多种亚克隆；（ 6） T 载体含有 T7， SP6 两种启动子，便于测序。34 . 理想的质粒载体应具备的条件（载体的结构特点） ：（ 1）必须具备复制起点；（ 2）具有抗生素抗性基因；（ 3）具有若干核酸内切限制酶的酶切位点；（ 4）具有较小的分

28、子量，较高的拷贝数。35 .入噬菌体基因组结构（1）左侧区，自基因 A到基因J,包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因；（ 2）中央区，介于基因J 与基因 N 之间，非必要区，编码的基因与保持噬菌斑形成能力无关，但包含了一些与重组有关的基因， 以及使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去的 int 基因， 和把原噬菌体从寄主染色体上删除下来的 xis 基因；（ 3）右侧区，位于N 基因的右侧，包括全部主要的调控基因，复制基因，溶菌基因。36 .入噬菌体载体的主要类型取代型，插入型37 .入ZAP的结构特点入ZAP是一种典型的插入型入噬菌体载体，可将插入的DNA片段直接从 入载体转移到

29、质粒载体。其结构特点：（ 1 ）其两侧是由两个单链 DNA 噬菌体 f1 的复制信号，即 f1 起始子和 f1 终止子包围着；（ 2 ）含有一个可以在体内发生删除作用的 pBluescript 噬菌粒的 DNA 片段；（ 3 ） 在 pBluescript 噬菌粒两端有T3 和 T7 噬菌体启动子的多克隆位点区， 可制备 RNA 探针。38. 入ZAP的优点（ 1） 具有多种核酸内切限制酶的单切点， 可以克隆分子量达到 10kb 左右的外源 DNA 片段；（ 2）在插入外源DNA 序列保证正确的取向和正确的读码结构的情况下，能够与外源DNA表达的蛋白形成融合蛋白；（ 3） LacZ基因的N端有

30、6个单克隆位点，能够发生3-半乳糖昔酶的插入失活效应，故可以在 X-gal 显色反应平板上筛选重组体分子；（ 4）利用T3 或 T7 启动子能够转录任一条链的 mRNA ，可以方便制备外源DNA 插入序列的转录本；（ 5）通过内删除作用，插入的外源 DNA可自动从入噬菌体载体转移到细菌质粒载体便于构建限制图谱或测序，省略了亚克隆。39. 柯斯质粒及其特点柯斯质粒：是一类人工构建的含有入噬菌体DNA的cos序列，和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，其DNA 可以在体外被包装到噬菌体的外壳内。 其基本特点：（1）具有入噬菌体的特性；（2）具有质粒载体的特性；（ 3）具有高容量的克隆能力；（ 4）具有

31、与同源序列的质粒进行重组的能力。40. M13 克隆体系M13 克隆体系， 包括 M13 噬菌体本身和寄主菌株两个组成部分。 二者单独都不能产生有功能的3半乳糖甘酶，只有二者结合才能产生此酶，这种酶的活性可用X-gal显色反应法测定出来。M13 载体系列的优点：（ 1 ）可以分离特定的 DNA 单链序列； （ 2 ）可以用组织化学测试技术检测；（ 3 ）在 LacZ 基因上具有多克隆位点，便于外源基因的插入、检测；（ 4 ）可以定向克隆。顺反子内互补作用： 是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。41 .噬菌粒载体：是一类有质粒载体

32、和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 结构特点：具有两个复制起点， 质粒复制点和噬菌体复制点，有抗生素标记信号， 与形态发生有关的DNA序列。42 . mRNA差别显示法分离目的基因的优缺点这是建立在基因差别表达的理论基础上，通过比较不同的个体、或是同一个体的不同组织、 甚至不同的发育阶段之间的mRNA种的差异，应用反转录PCR技术而发展出来的一种分离产物未知基因的方法。简称DDRT -PCRO主要包括：反转录反应，PCR反应，凝胶电泳。(考试不要求)基本原理 ：几乎所有的真核基因 mRNA分子的3'左端都有一段poly(A)尾巴。 因此，在RNA聚合酶作用下，可按 mRNA为模

33、板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根 据mRNA分子3'-端序列结构分析，在这段 poly(A)序列起点碱基之前的两个碱基，除了倒二位 的碱基为A的情况之外，只能有如下12种可能的排列组合；根据上述mRNA分子结构特征设计3'-端锚定引物，用以反转录mRNA合成第一链cDNA的下游引物，共12种。其通式为：5-T11MN或5 -T12MN ,其中T11或T12表示11个或12个连续的 T核甘酸，M表示除T以外 的任何一种核甘酸，即 A、G、C, N表示任何一种核甘酸，即 A、T、G、Co由此可见MN(3X 4) 总共只有12种不同的排列组合方式。由此可知，使用5

34、'-TiiMN引物或5'-T12MN引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的位序列结构不同的12个分亚群体。对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类 cDNA的PCR先择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。优点：(1)可以同时比较多个样品间基因表达的差异；(2)可以同时检测到“上游”及“下游”基因；(3)检测灵敏度高，所需样品少，经过PCR扩增一些低丰度的 mRNA也可以被检测出来； (4)结合使用了 PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法的使用显得更加简单方便。 缺点：(1)假

35、阳性比例甚高，通常可高达50%-70%;(2)扩增的差别条带的分子长度比较短小，一般在110450bp之间；(3)工作量大，理论统计为分离一种差别表达的基因应检测的差示组为80X3=240对反应；42 . DNA标签法分离目的基因的原理DNA标签法(DNA tagging),是根据DNA的插入作用发展出来的一种分离基因的方法，其 依据的原理是：当一段特定的 DNA插入到植物基因组中目的基因的内部、或其邻近位点时，便 会诱发该基因发生突变，并最终导致表型变化，形成突变体(突变植株)；如果此段 DNA插入序列是已知的，那么它便可以用来作为DNA杂交的分子探针，从突变体植株的基因组 DNA文库中筛选

36、到突变的基因；利用此突变基因作探针，就能从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。43 .酵母双杂交体系的基本原理酵母双杂交体系(two-hybrid system)是90年代初期在转录因子结构基础上发展起来的一种 敏感的体内鉴定基因的方法。它可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白(target protein)相互作用的蛋白质的编码基因。许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构生可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。酿酒酵母的半乳糖甘酶基因的转录激活因子GAL4在N端1147位氨基酸区段有一个 DNA结合域（DNA-BD ,在C端768881位氨基酸区段有一个转录激活域（简称

37、 AD。DNA-BDf归够识 别位于GAL4效应基因上游的一个特定区段，即上游激活序列（ UAS,并与之结合。而 AD则是通 过同转录机构中的其它成份之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。 这两个结构域都是激活基因转录的必要条件， 而且在正常的情况下它们都是同一种蛋白质的组成部分。 但是， 如 果应用DNAM组技术把它们从形体上彼此分开，并放置在同一寄主细胞中表达。那么，由此产生的GAL4 DNA-BD AD多肽，彼此之间就不会直接地发生相互作用，故不能激活其相关的效应基 因进行转录。实验同样也证明，应用重组DN破术，也可以将来自同一个转录因子的、或是两种不同转录因子的、分开的两种结

38、构域（即DNA-BD AD）,在体内重新组装成具有功能的转录因子， 从而激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达。44.新基因功能鉴定的方法（ 1）转基因技术使基因过表达；（ 4）基因序列同源比对；（ 7）应用报告基因；（ 10）遗传互补法；45.同源基因的类型（ 2 ）基因剔除；5）蛋白质产物的结构与功能分析；8 ）反译 RNA 技术；11）基因表达系列分析法；3） RNA 干扰技术；6）基因定点突变技术；9）化学遗传方法；12 ）酵母双杂交技术。1）直向同源基因：又叫定向进化同源基因，是从共同的祖先基因进化而来，分布在不同的物种中。2）共生同源基因：又叫平行进化同源基因，指存在于同种生物中

39、的一类同源基因。46. RNA 干扰 ： 小分子量的外源双链RNA 进入寄主细胞之后， 便可促进与其同源的内源mRNA发生特异性的降解作用， 从而高效而特异的阻断体内相应基因的活性 （即呈现基因沉默的状态） ， 在细胞内发挥基因剔除的作用，此种现象叫做RNA 干扰简称 RNAi47. 切丁酶：是一种 RNaselD样的核酸内切酶。其生物学功能是将双链RNA分子切成2123bp的小分子量干扰RNA ，即 siRNA 。48. 调节子：指在大肠杆菌基因组中，其表达活性受同一种基因编码的蛋白质协同调节的，一组不连续相邻排列的结构基因。 调节子与操纵子的不同之处在于， 后者的结构基因是彼此相邻排列的，

40、而前者的结构基因则是分散于染色体的不同部位，甚至是位于不同的染色体上。49. 原核基因表达的调节方式（ 1）操纵子的调节方式；功能相关的若干基因聚集在一起组成一个操纵子， 即在同一个启动子控制下的一种单一的转 录单位。（ 2）调节子的调节方式；调节子： 大肠杆菌基因组中，其表达活性受到同一种调节蛋白调节，并对同一种信号做出反应的一组不连续也不相邻的结构基因或者操纵子。两种常见的大肠杆菌调节子：麦芽糖调节子和精氨酸调节子。（ 3）适应性效应的调节方式 大肠杆菌在外界环境发生变化时，其新陈代谢能够迅速的改变，叫适应性效应。（ 4）正调节与负调节正调节：当调节蛋白处于激活状态时，能够启动操纵子的表达

41、 ，这样的操纵子受到了正调 节蛋白的正调节。负调节： 当一种调节蛋白处于激活状态时， 能够关闭操纵子的表达活性， 这样的操纵子受到 了阻遏物的调节。（ 5）程序化环路与快速开关调节程序化环路：大肠杆菌按照预先决定的遗传程序对基因表达进行控制的调节方式。快速开关调节： 在大肠杆菌中， 为了适应环境的瞬时变化， 迅速地开启或关闭有关基因的表 达活性，对基因表达进行调控。50. 转录与复制的比较（ 1）对引物的需求有差别：复制需要同时存在模板和引物， DNA 聚合酶才能启动新链的合成，而转录不需要引物， RNA 聚合酶便可启动新链的合成；（ 2）使用的底物不完全相同：复制的底物是脱氧核糖核酸，转录的

42、底物是核糖核苷酸（ 3）与模板结合的状:态不一样：复制是半保留复制，新链与模板链结合在一起除非碱变性或高温；转录新合成的 RNA 链从模板上解离下来；（4） 精确性程度相差悬殊：转录过程中， 错误的频率是10-4 ； 在复制过程中， 出错的频率是10-7，复制的保真性是转录的 1000 被倍；（ 5）涉及的范围不同：DNA 复制 :涉及整个基因组；转录则只涉及部分序列。51. RNA 编辑： 在某些基因的转录后加工过程中， 会有大量的尿嘧啶核苷酸加入到pre-mRNA 上，或者从pre-mRNA 上删除，或发生核苷酸的取代，如此碱基饰变的结果，使得 RNA 转录物的核苷酸编码序列与其对应的 DNA 链的核苷酸编码序列并不完全匹配。这种 RNA 转录物成熟、修饰过程中发生的核苷酸碱基的加入或删除的现象，叫做RNA 编辑。52. 引导 RNA 分子结构gRNA是一类长度为5080个核甘酸，可以同 mRNA转录物杂交的小分子量RNA分子。gRNA 分子能够使mRNA 分子缺失核苷酸，或将核苷酸加入到 mRNA 分子上，而这种缺失或加入的核苷酸通常是尿嘧啶核苷酸。gRNA 的分子结构：（1）在gRNA的5'末端有一段锚定区，以特殊的G -U配对方式与pre-mRNA编辑序列互补， 锚定序列促进gRNA 与 pre-mRNA 中的编辑区互补，特异结合；（ 2 ）在 gRNA 分子