自体荧光电子支气管镜技术参数(精选文档)

1、自体荧光电子支气管镜技术参数（精选文档）（文档可以直接使用，也可根据实际需要修改使用 ，可编辑欢迎下载）自体荧光电子支气管镜技术参数一、自体荧光影像处理机 *1台1数字信号处理系统可提供清晰画质2成像系统彩色CCD3正常照明灯300W氙气冷光源*4激发光半导体激光二极管（波长 408nm）内镜先端射出能量（20 40mW）5应急灯白色LED6观察图像转换面板/内镜操作部按钮*7输出图像正常图像/荧光图像/双屏图像/混合图像8视频输出3RGBS ； 2Y/C ； 1S-VIDEO ； 1DV9数字输出3个串行接口10外部设备控制个外部设备接口，1个R-232C连接器11耗电功率4.8A (120

2、V NTSC), 2.5A (230V PAL)12体积/重量宽:450mm 长:594mm 高:200mm/ 27Kg*13兼容性自体荧光电子支气管镜、普通电子支气管镜镜等二、自荧光电子支气管镜*1条1视角> 120前视）2景深>-50mm3前端弯曲角度上：> 180?下：> 130?4先端部径< 6.3mm插入管径< 6.2mm*5钳道直径> 2.8mm6工作长度> 600mm7总长度> 860mm8观察图像变换操作部按钮9消毒全浸泡消毒三、全高清液晶监视器（1M ） *1台1屏幕尺寸及类型19寸TFT彩色液晶显示屏2自然分辨率1280

3、*10243点距0.294*0.294四、台车*1台1配套台车可移动，带悬臂可悬挂显示器，安装主机及自荧光电子支气管镜荧光灯电子镇流器电路简介上海时代之光照明电器检测 王月丽一. 输入电路这一电子镇流器的输入电路，是一个兼有共模和差模复合的EMI滤波电路1. 进线处F是电流熔丝（保险丝），它的作用是一旦电子镇流器内发生故障状态时，能及时熔断，从而 防止了故障的扩大和危及安全的事故发生。2. 并联在进线处的RV是压敏电阻，策妊灯电子镇深器电原理圈V它的伏安特性如图2，当它两端的 电压没达到它的阀门电压值时，它 呈现阻值很大的（ 10kQ的电 阻特性，当两端的电压超出阀门电 压时，其阻值会迅速下降

4、，流过其 电流也会急剧上升。它的作用是：（1）当电源内有雷电感应，大用电器图2的自感电动势，触发脉冲电压等残留 瞬时脉冲作用在电子镇流器的输入端时，能把超出 470V或390V峰值的脉冲电压 泄放掉，从而保护了电子镇流器的内部电路免受高压脉冲的冲击。即压敏电阻兼 有EMS的防护功能。（2）当电子镇流器的输入端被错误地接上远超出其额定值 的电压时，（例如被接到380V电源上），压敏电阻会迅速导通，其持续的大泄放 电流能把保险丝熔断，从而达到保护电子镇流器内部电路的目的。更强才能保证EMI标准中传导项目的不超标。从电路的输入侧 A、A/端分析，电子镇流器传向电网的高频干扰信号既有以 A和A互为两个

5、极的差模干扰信号，又 有以A和A /为共同一个极而以接地为另一个极的共模干扰信号。图中C1和C11是典型的差模信号旁路电容，把电子镇流器产生的差模信号在此处短路掉。L3主要是针对这一电路的A点干扰信号相对比A /点更多而设立的，它主要是起到阻碍 A 点的差模干扰信号向外传导的作用，但同时也对 A点的共模干扰信号有阻碍作用。L2和C13、C14组成了典型的共模滤波电路，其中 C13和C14分别接在两个进线端 上然后接地，从而达到对共模干扰信号的对地短接的旁路作用。L2的结构为共轭型，它在一个磁芯上同时绕有两组相互独立且对称的绕组，在这一电路中两组绕 组按极性接成共模滤波电路，这种接法对电子镇流器

6、的电源电流来说，流过两绕 组的电流大小相等但方向相反，所以电源电流的流过不会使L2磁芯饱和。这样可以用没有磁隙的闭合磁回路的磁芯，在相同的线圈匝数的情况下，可以得到更大 的电感量，更有利于滤除EMI的传导干扰。二. 整流电路和电子泵反馈电路1.电子镇流器由D1-D4组成桥式全波整流电路，把交流电源变成直流，这里的 C 2也承担了直流端的EMI传导信号的差模滤波作用。C5和C6起到了直流的滤波作 用，但由于其电容量不大，所以对直流纹波的滤除作用很有限，主要是作为两个 串联的电容组成半桥电路，在高频谐振中给两个半周分别提供能量。2作为电子镇流器内直流电位的B, B/端口电位的建立，主要依靠D5,

7、D6, D 7, D8和电解电容E1, E2组成的电子泵电路来实现。在接通交流电源的时候，C5和C6上的电势会立刻建立，所以电路会起振。一旦电路起振，C5和C6的中点，G点的电位会在较大的幅度内随高频谐振的频率而波动。当G点的电位相对于Bz点偏高时，G点电能通过D8对电解电容E2进行充电。当G点的电位相对于B/偏 低时，充电电流经电解电容E1和D7构成的回路进行充电。对E1和E2的充电是在 高频谐振的两个半周期内分别进行的，但 E1和E2的放电是并联进行的，当B与B /之间的电压低于E1及（在整流后脉动直流纹波的波谷端）E1和E2分别通过D5和E2的端电压时，D6对直流电路放电，从而补充了脉动

8、电流纹波电压低谷段的电压，使B和B /两点间的直流电压稳定。这种电子泵电路的优点是：（1）由于电子泵电路的存 在，使B和B/两点间的直流纹波大大减小，从而使高频灯电流包络波的波峰比明 显变好（由普通续流电路的2.1左右下降到1.7以下）。（2）由于电解电容没有直 接接在全波整流电路后面，使4个整流二极管的导通角度增大到接近180°,使得 电子镇流器输入电流波形明显改善，更接近于正弦波形，所以谐波能达到IEC61000-3-2标准的对应要求。三. 主要谐振电路本电路的主要振荡电路工作原理是：接通电源后，正极高电位通过R3对C3充电，当C3电压超过DB3的开门电压（30V）和02的be结

9、电压（0.7V）时， 触发电流经DB3和R6注入Q2的b极，Q2开始导通。电容C6上的能量分成 两路，一路从C6正端出发经上灯的灯丝 CMPBRP 灯丝T1L1 -3 QPR7 回到C6负端。另一路从C6正端出发经下灯的灯丝 PBR C1（ 灯丝T2 L1 - 3-QMR7回到C6负端，在上述过程中，由于两支电流都流经高频变压器L1-3绕组，此时L1-1上感应的电压为上负下正，只会加深 Q1的截止，而L1-2上的感应电压 是上正下负，其强烈的正反馈使 Q2迅速进入饱和，Q2形成饱和导通。但随着C8 和C10上电量的逐步充满，Q2的Ice很快下降，Q2将脱离饱和而转向截止，由于此 时流经L1-3

10、绕组的从右到左的电流是由大到小的变化，贮存在（根据焦耳楞次定律）这一释放能量在 L1-2上L1磁芯中的磁场能量释放出来， 将感应出上负下正的电势，使 Q2进一步进入截止，而在L1-1上感应出上正下负的 电势，使Q1开始导通。Q1一旦导通后，C5上的电能也分成两路，一路从C5上端 出发经Q仁RgL1 -3T1上灯的灯丝PBR1与C8上所充的下负上正的电能串 联后经上灯的另一灯丝到达C5负端。另一路从C5上端出发经Q仁RgL1 -3T 2下灯的灯丝与C10上所充有的上负下正的电能串联后经 PBR2回到C5负端。Q1 的导通一方面使C8和C10上的原来的能量得到释放，同时也使这两个电容分别充 上了与

11、原来极性相反的电能，另一方面这一电流从左到右地流过L1-3使L1-2上感应出上负下正的电势，进一步加深 Q2的截止，而L1-1上感应出的电势使Q1迅速进入饱和区，同理，随着C8和C10上反向充电的充满，Q1将脱离饱和而转向截止 ，此时流经L1-3绕组的从左到右的电流是由大到小的变化，贮存在 L1磁芯中的磁 场能量释放后在L1-1上感应出上负下正的电势，使Q1进一步进入截止，而在L1-2 上感应出上正下负的电势将使Q2开始导通，从而完成一个完整的振荡周期。由于 开始起振后，Q2的每次导通（通过D12）同时也释放了 C3上的电能，并且R3和C 3的组合时间常数远大于电路振荡的时间常数，所以在电路起

12、振后C3上不能达到DB3所需的导通电压。所以也不会再产生多余的触发信号。又因为C5和C6的电容量远大于C8和C10 （一个数量级关系），并且L1-3的电感量远小于T1和T2,所以 电路的振荡频率基本由C8，C10和T1，T2的电容和电感量所决定。电路起振后， 一方面有谐振电流流过两支灯管的阴极，起到预热阴极的作用。另一方面在电感 T1和T2上将产生UL=EQ的高电势，而电容C8和C10上产生UC=-EQ的高电势，式 中E是半桥振荡时C5和 C6提供的电动势，一般为120V 150V，Q是两支LC谐振 回路的谐振品质因数，一般在8 18之间。两支已进行预热的灯管就是在 C8和C10 的谐振电势下

13、被击穿并启动的。灯进入正常工作状态后，相当于在串谐回路中的电容 C8和 C10上并联了一个阻值 在一定的范围内变动的电阻，这一特点使串谐回路的谐振强度明显下降，谐振的 频率也随着C8和C10充电时间的放慢而下降，只要这部分电路的匹配合理，最后 电子镇流器和灯会稳定地工作。四.异常保护电路电路中PBR1和PBR2的作用是提供灯不启动和整流效应的异常状态保护的，这是 一种随温度变化会产生电化学效应的元件，称为万次自恢复保护丝。当灯启动时 有较大的预热电流流过它，但由于灯预热启动时的时间一般在0.4S-1S,这一短暂的时间内的启动电流作用在它上不会使温度有明显的上升，因此当灯已启动时它 还保持着常温

14、低阻状态。由于灯启动后流过它的电流大大减小，在这一启动后的 灯丝电流作用下它可以一直保持在低阻状态。一旦发生灯不启动或整流效应的异 常状态时，持续的启动电流急骤上升，从而使串谐回路的谐振电流大大减小，达 到了灯异常状态时电子镇流器具有自 我保护的目的。自恢复保险丝的另一特性是一旦进入高阻状态，只需很小的电流（一般10mA ）就能保持在高阻的状态，一般在切断电源，待其冷却后（约1分钟），才能恢复原来的低阻状态。选用万次自恢复保险丝串入在启动回路中作为电子镇流器的异常状态保护，应注 意以下几点：（1）自恢复保险丝的工作电流要与实际的电子镇流器的电路相匹配，即在启动 后正常工作时，流过它的电流应明显

15、小于它的动作电流。但异常状态时的电流也 应达到它的工作电流。在异常电流的作用下，其动作时间一般在5S 20S间为好。动作太早了会产生在气温低，灯不易启动时灯还没点亮就进入保护状态，动作 太迟了又会使电子镇流器内元件因长时间承受大电流而损坏。(2) 自恢复保险丝的安装位置应选在周围无明显发热元件的位置，在电子镇流 器中，功率三极管，输出磁芯等在工作时都会发热，这一热量如果在很小的空间 内作用时间较长，会使小环境温度上升，很可能使自恢复保险丝在气温较高或同 时受到灯的热辐射的共同作用下发生误动作。(3) 另外还在设计时使自恢复保险丝在动作温度和动作电流上留有余量，因为 电子镇流器工作的外壳温度tc

16、值一般应在50C 75C之间，低于50C的tc值在实际使用中往往是行不通的，因为电子镇流器在工作时自身的热量 虽说很小，但如果使用的条件通风散热情况都较差，并且外部的气温也较高，同 时还受到光源的热辐射影响时，就会使电子镇流器的外壳温度最热点达到或超出 50C。所以在选用自恢复保险丝以及设计电路时，应该充分考虑到电子镇流器在tc温度下连续工作时，不能进入保护状态。只有在发生实际的异 常状态时，才可靠进入保护状态。第二节 荧光抗体技术一、荧光抗体的制备（一）抗体的荧光素标记用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取igg后再作标记。

17、作为标记的荧光素应符合以下要求：应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。以 fitc 标记为例，搅拌标记法为：先将待标记的蛋白质 溶液用0.5ml/lph9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入fitc溶液，在室温持续搅拌 46h后，离心，上清即为标记物。此法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的

18、抗体溶液。优点是标记时间短， 荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较台强的非特异性荧光染色。透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含 fitc 的 0.01mol/lph9.4 碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再 对 pbs 透析法去除游离色素。低速离心，取上清。标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。纯化方法 可采用透析法或层析分离法。二）荧光抗体的鉴定荧光抗体在使用前应加以鉴定。鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。抗体效价可以用琼脂双

19、扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至a28o1 1.0，分别测读a28o （蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰,按公式计算。按公式计算。加035X A忸A(KB200) F/P-严f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p = 1.5为宜，用于活细胞染色的以f/p = 2.4为宜。抗体工作浓度的确定方法类似elisa间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自 1:41:256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释

20、度为荧光抗体工作浓度。20C冻存，这样就可放置34荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，- 年。在4°C中一般也可存放 12年。二、免疫荧光显微技术免疫荧显微技术的基本原理是：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。（一）标本的制作 荧光显微技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位。因此标本制作的好坏直 接影响到检测的结果。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。标本切片要

21、求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。 标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。按不同标本可制作涂片、印片或切片。组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。石蜡切片因操作烦琐，结果不稳定，非特异反应强等已少应用。组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上12层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。涂片或印片制成后应迅速吹干、封装。置-10C保存或立即使用。（二）荧光抗体染色于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般可用2537°C 30min，不耐热抗

22、原的检测则以 4'C过夜为宜。用 pbs充分洗涤，干燥。（三）荧光显微镜检查经荧光抗体染色的标本，需要在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果。荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。首先要选择好光源或滤光片。滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。在光源前面的一组激发滤光片，其作用是提供合适的激发光。激发滤光片有两种。mg为紫外光滤片，只允许波长 275400nm的紫外光通过，最大透光度在 365nm ; bg为蓝紫外光滤 片，只允许波长325 500nm的蓝外光通过，最大透光度为 410nm。靠近目镜的一组阻挡滤光片（又称吸收滤光片或抑制滤光片）

23、的作用是滤除激发光，只允许荧光通过。透光范围为410650nm，代号有og （橙观察rb200标记物时，可选用 bg12与og5配合（四）实验的类型1 直接法用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合（图17-1 ）。本法操作简便,特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。待检图17-1直接免疫荧光法原理示意图2 间接法可用于检测抗原和抗体，原理见图17-2。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需 应用一种荧光抗体。图17-2间接免疫

24、荧光法原理示意图荧光标记 抗原 披悴 补悴抗补体抗体图17-3补体结合免疫荧光法原理示意图3 补体结合法本法是间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光标记的抗补体 抗体进行示踪（图17-3 ）。本法敏感度高，且只需一种抗体。但易岀现非特异性染色，加之补体不稳定， 每次需采新鲜豚鼠血清，操作复杂。因此较少应用。4标记法本法用fitc及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时, 可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。三、在医学检验中的应用荧光抗体技术在临床检验上已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等。在细菌学检验中主 要用于菌种的鉴定。

25、标本材料可以是培养物、感染组织、病人分泌排泄物等。本法较其他鉴定细菌的血清 学方法速度快、操作简单、敏感性高，但在细菌实验诊断中，一般只能作为一种补充手段使用，而不能代 替常规诊断。荧光抗体染色法对脑膜炎奈氏菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、布氏杆菌和炭疽杆菌等的实验诊 断有较好效果。荧光间接染色法测定血清中的抗体，可用于流行病学调查和临床回顾诊断。免疫荧光用于 梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异性诊断常用方法之一。免疫荧光技术在病毒学检验中有重要意义，因为 普通光学显微镜看不到病毒，用荧光抗体染色法可检岀病毒及其繁殖情况。有效的检测疟疾抗体的方法。 常用抗原为疟疾患者血液中红内期裂殖体抗原。 ifat

26、对肠外阿米巴、 尤其是阿 米巴肝脓肿也有很高的诊断价值，所用抗原是阿米巴培养物悬液或提取的可溶性抗原。免疫荧光法还是检测自身抗体的好工具，在自身免疫病的实验诊断中应用广泛。其突出优点是能以简单方法同时检测抗体和与抗体起特异反应的组织成分，并能在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。主 要有抗核抗体、抗平滑肌抗体和抗线粒体抗体等。抗核抗体的检测最常采用鼠肝作核抗原，可做成冰冻切 片、印片或匀浆。用组织培养细胞如 hep-2 细胞或 hela 细胞涂片还可检出抗着丝点抗体、抗中性粒细胞浆 抗体等。应用免疫荧光技术可以检出的其他自身抗体有抗(胃)壁细胞抗体、抗双链dna 抗体、抗甲状腺球蛋白抗体、

27、抗甲状腺微粒体抗体、抗骨髓肌抗体及抗肾上腺抗体等。荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析( flowcytometry )。在这种分析方法中检测仪器不是荧光显 微镜，检测对象不是固定了的标本，而是将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷 嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各处数据。这种方法可用于 检测细胞大小、折散率、粘滞度等，更常用于 t 细胞亚群等的检测。免疫荧光技术免疫荧光技术( Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜 技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括

28、荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但 能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是 在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。（一） 原理与方法 免疫学的基本反应是抗原 -抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原 抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影（二 ） 荧光抗体的制备1. 免疫血清的制备及免疫球蛋白

29、的提纯制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。为此， 用于免疫的抗原必须高度提纯，尽可能不含其他非特异性的抗抗原物质，血 清的效价与特异性是矛盾的， 通常以高效价的免疫血清为好， 因为用这种血清制备荧光抗体， 即使其中含有少量非特异抗体， 也可以通过稀释法将其除去。 为提高血清效价， 在制备免疫 原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原 1 份， 无水羊毛脂 1 份，液体石蜡 2 份混合，待充分乳化后，免疫动物， 即可能获得高效价的免疫 血清。 用于荧光素标记的免疫血清， 需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还 可以排除丫球蛋白以外的蛋白质

30、，减少非特异性荧光的出现。从免疫血清中将特异性抗体提纯于荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。 在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体， 主要 是 IgG 类，其提纯方法很多，但以饱和硫酸铵盐析法比较简便，也可用分子筛层析法（即 葡聚糖凝胶过滤） ，以及离子交换层析法等，或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步 纯化。2. 荧光色素的标记能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素， 必须具有化学上的活性基因， 能与蛋白质稳定结合，且 不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。 适于标记蛋白的荧光色素主要有异硫 氰酸荧光黄（ fluorescein

31、 isothiocyanate ， FITC ），四乙基罗达明（ rho-damine B200 ， RB200 ） 和四甲基异硫氰基罗达明 （tetramethyl rhodamine isotheynate ， TMRITC） 。实际上目前应用最 多的只有异硫氰酸荧光黄一种。（1）FITC 标记 FITC 为黄色结晶形粉末， 分子量为 389，易溶于水和酒精等溶剂中，溶解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为 490-495nm ， FITC 的溶液不稳定，易因水解或迭聚而变质， 故需在配好后 2h 内应用。FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的&氨基）结合

32、，形成荧光抗体结合物。 一个分子的 IgG 有86 个赖氨酸残基， 但一般最多只能标记 15-20个。 直接标记法取抗体球蛋白溶液10ml,碳酸盐缓冲液3ml,生理盐水17ml,混合，在4 C电磁搅拌下加FITC3mg （先溶解在3ml缓冲液中），在4C继续搅拌4-6h，将结合物通过已 平衡好的Sephadex G25柱，以除去未结合的游离荧光素。 透析标记法将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（0.25mol/L , pH9.0调动1% （W/V ），并装入透析袋中，按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于FITC液中，于4C搅拌16-18h取出透析袋于

33、0.01mol/L , pH7.2PBS中透析4h, 将结合物通过已平衡好的Sephadex G25 柱，去除游离荧光素。（2）RB200 标记 本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分子量为580,最大吸收光谱为 570nm,呈明亮的橙色荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别， 故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。 方法为： 取1g RB200及五氯化磷（PCL5）2g放乳钵中研磨 5min （在毒气操作橱中），加10ml无水 丙酮，放置5min，随时搅拌，过滤，用所得溶液进行结合。将每亳升血清用1ml生理盐水及1ml碳酸盐缓冲液（0

34、.5mol/L，pH9.5）稀释，逐滴加入 0.1ml RB200溶液，随加随搅拌， 在0-4 C继续搅拌12-18h。（3）TMRITC 标记 TMRITC 为紫红色粉末,性能比较稳定,分子量为443,最大吸收光谱为550nm,呈橙红色荧光。其结合方法与FITC的直接标记法相同，只是所加色素量为蛋白质量的 1/30-1/40,结合时间持续 16-18h。（4）影响标记的主要因素 温度、时间、酸碱度和标记量 4个因素。 温度低, 标记时间长, 温度高，标记时间应短。FITC0-4 C以6-12h为宜，20-25 C以1-2h为宜，37 C 30-45min为宜。 pH 低时,标记较慢, pH

35、值偏高（大于 10）,抗体易变性, pH 值 9.0-9.5 最为适宜。抗 体蛋白含量低,标记慢,以每毫升含 20-25mg 蛋白为宜。至于标记方法,各有特点,但均 不能去除非特异荧光染色因素。透析法适用于小体积的标记。3. 标记抗体的纯化 抗体标记以后,应立即进行纯化处理,以消除或降低非特异性染色和特 异交叉染色。其步骤如下：标记抗体溶液J透析或凝胶过滤去除游离荧光色素（粗制荧光抗体）J DEAE纤维素层析去除过度标记的蛋白分子（精制荧光抗体）航原交叉吸收或组织制剂吸收去除特异交叉反应的标记杭体免疫纯荧光抗体）根据免疫荧光试剂的具体用途， 纯化的方法可以不同， 并不是每一种荧光试剂都须经过以

36、上 全部过程。 对于某些细菌诊断试剂， 只要除去游离荧光素就可以， 检测病毒抗原的荧光抗体 一般要求下述处理：(1) 游离荧光素的去除 去除标记过程中未与蛋白质结合的游离荧光素，是纯化标记试剂的 最基本要求，不经过这一步处理，任何免疫荧光试剂都不能应用。 半透膜透析法 利用荧光色素分子可以通过半透膜，而蛋白分子则因分子量大不能通过 的原理， 逐步将游离色素除去。 先将标记好的抗体溶液装于透析袋或玻璃纸袋内， 注意使液 面上留有一定空间， 扎紧袋口， 先用流动自来水透析 5 min ，再转入 PBS ( 0.01mol/L ，pH7.2) 或生理盐水中继续透析，外液量至少大于内液量100倍，透析

37、应在低温(0-4 C)下进行，每天换液 3-4 次，整个透析时间约需 1 周左右，时间过长容易造成蛋白质变性，影响荧光抗 体的质量。取透析液(外液)以紫外线灯检查，若无荧光出现，即可停止透析。 凝胶过滤法 利用荧光色素分子和蛋白质分子量的悬殊差别，通过分子筛除去游离荧光素，一般1h以内即能完成操作，但最好与透析法结合进行。先将标记抗体溶液透析4 h,除去大部分游离荧光素和其他小分子物质以后， 再进行凝胶过滤， 这样有利于保护凝胶柱， 延 长使用时间。凝胶柱sephadex G25和G50装好后，以洗脱液(0.001mol/L或0.005mol/L PBS， )平衡，然后加入样品，样品与柱床容积

38、的比例1:2以下皆可。样品全部进入柱床后,即可进行洗脱。应用此法可使游离荧光素完全除去,同时荧光抗体可以100%回收。(2) 过度标记的蛋白分子的去除 去除游离荧光素后,结合物中存在的未标记的和过度标记的蛋白质，是降低染色效价和出现非特异性染色的主要因素。常用的方法是DEAE-纤维素或 DEAD- 葡聚糖凝胶层析,结合物通过层析柱后,过度标记的部分(易出现非特异性)被 吸附, 过低标记的或未标记的部分(易降低敏感性)自由流出,从而可以得到荧光素与蛋白 质结合比最适的部分。DEAD- 纤维柱用 PBS 平衡后,柱上端放一大小合适的滤纸片,打开下口,调解流速至每分 钟 10-20 滴左右,待柱上液

39、面剩一薄层 PBS 时,用吸管滴加标记样品,样品进入柱床尚离 一薄层时,用适量 PBS 冲洗管壁,然后用大量 0.01mol/L , pH7.2PBS 洗脱,用 20%磺基水 杨酸液试测洗脱液。 待蛋白出现阳性反应时即可收集, 蛋白反应阴转时停止收集, 该洗脱液 即为纯化的标记抗体。(3) 特异交叉或额外应用性标记抗体的去除 去除特异交叉或额外应用标记抗体,常用组织 粉末吸收法,最常用的是肝粉, 这一步处理对标记的抗体来说,损失是很大的,一般可省去 这一步。4. 标记抗体的鉴定 经过以上各种程序所获得的精制荧光抗体,使用前须做特异性测定、敏 感性鉴定以及纯度测定后,才可正式用于荧光抗体染色。参

40、考文献19891 殷震、刘景华、动物病毒学,科学出版社, 1985 2 刘玉斌、敬仕金,动物免疫学实验技术,吉林科学技术出版社,4 杜平，医用实验病毒学，人民军医出版社， 19955 北京医学院微生物学教研室，实验免疫，人民卫生出版社， 19806 南京农业大学，家畜传染病学（第二版） ，农业出版社， 1986一、荧光素 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止（一般持续10-7 10-8s ）。可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光色素。目前主要常用的荧光色素有以下3种：（一）异硫氰酸荧光素（ Fluoresceinisothiocyanate, GIT

41、C ）呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2 年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光谱为490495nm，最大发射光谱为520530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为398.4（图 3-5）。在碱性条件下， FITC 的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。反应式如下（图 3-6 ）：一个lg分子上最多能 标记1520个FITC分子图3-5 FITC的吸收光谱和发射光谱沖2ISiFITc忻记科图3-6 抗体的FITC标记反应式（二）四乙基罗达明（tetraethylrodamineB200, R

42、B200)射光谱为595600nm,呈明亮橙红色荧光。分子量为580 （图3-7）8氨基反RB200在五氯化磷（PCI5 ）作用下转变成磺酰氯（SO2CI ），在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸 应结合而标记在蛋白分子上。化学反应式如下（图3-8 ）。图3-7RB200在可见光区的吸收图 3-8RB200标记抗体反应光谱和荧光光谱图3-8RB200标记抗体反应（三）四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC )它是一种紫红色粉末较稳定。其最大吸收光谱为 550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰

43、（图3-9），与蛋白质结合方式同 TITC。它可用于双标记示踪研究。化学结构式如下（图3-10）图3-9TMRITC在可见光区的吸收光谱和发射光谱图3-10 TMRITC结构式、荧光素标记抗体的方法（一） FITC标记抗体的方法1. Marsshall 氏法（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/LpH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（2550ml ）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml八 pH7.2或8.0的 0.01 mol/L PBS 等。（2）方法及步骤： 抗体的准备：取适量已知球蛋白

44、浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不 起泡沫为宜）510min荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。 结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约510min内加完），加毕后，继续搅拌 1218h。结合期间应保持蛋白溶液于 4'C左 右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4C冰箱或冰库中。 透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min ） 20min，除去其中少量之

45、沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（04C）过夜。 过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定（图3-11，图-3-12 ）。图 3-11 Sephadex G-25 对 FITCLkHfl 5*H9r4Q. ± 9 £ 3 4H12吋円J图 3-12FITC与家兔IgG球蛋白在25 C和2°C时结合的动力学（Kawamura1964 ）洗脱液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2 ）;过滤量:12ml标记全球蛋白液（过滤前未透析）;收集量:20ml（稀释1.7倍）。分别以

46、1mgFITC 溶于2份1mol0.5mol/L碳酸重碳酸盐缓冲液（分别为 pH9.5和pH9.0 ），于2C下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于2C下，另一半置 25 C下。间隔一定时间后各取出 0.5ml 通过 sephadexG-25去游离FITC，由上计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。2. Chadwick 氏法Ph8.0 磷酸盐缓冲盐水、 1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶（ 25ml ）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、 烧杯（ 500ml ）、透析袋、棉线、玻棒等。（2 ）方法及步骤： 抗体准备：用o4CpH8.0磷酸盐缓冲盐

47、水将球蛋白溶液稀释至浓度为3040mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。 荧光色素准备：按每毫克蛋白加入荧光素 0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶 解。 将准备之抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在04C,冰箱中结合1824h。 透析和柱层析：方法同 Marshall氏法。3改良法（ 1963 年） 根据 Marshall氏法取高价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（ 0.15mol/LNaCl ）及缓冲液（ 0.15mol/LNaHC03 -la2CO3 PH9.0 ）稀释使每毫升内含蛋白10mg,缓冲液为总量的10%，降温至4°C,加入异硫

48、氰酸盐荧光素，（蛋白：荧光素 =5080mg:1mg ），在04C下电磁搅拌1214h。然后用半饱和和硫 酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4C）可以用半年以上，-20C保存可达2年以上。【附一】 0.01mol/L pH7.2 PBS 配法： NaCl18g 、 Na2HPO41.5g 、 KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸馏水中，校定 pH至7.2。【附二】 0.5mol/L pH9.0 碳酸盐缓冲液配法：取 0.5mol/LNa2CO3（5.3%）10ml 加入 0.5mol/LNaHCO3（4.

49、2%）90ml, 混合后，校定 pH 至 9.0。【附三】 3%重碳酸钠水溶液配法：称 1.5g 无水重碳酸钠充分溶解于 50ml 灭菌蒸馏水中即成。4透析标记法此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。（1 ）用 0.025mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9.0 ，将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓度，装入透析袋中。（2 ）用同一缓冲液将 FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4'C电磁搅拌下，透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用sephadex

50、G-50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装、贮存于4C中（图3-13 ）图3-13 标记抗体溶液通过 sephadex产胶柱层析分布（二）四乙基罗达明标记抗体方法取 1g RB200 及 PCL52g放在乳钵中研磨5min （在通风橱中）。然后加入 10 ml无水丙酮，放置5min，不断搅拌。过滤，用滤液进行标记抗体剩余部分吸附在滤纸上，4 'C干燥保存。取抗体（20mg/ml ）每毫升加入生理盐水和 0.5mol/L pH9.0的碳酸盐缓冲液各1ml稀释。逐滴加入0.1ml柱层析，除去游离荧光素，分装，贮存于4C备用三）四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法1 ) IgG10ml (6mg/m

51、l) 在 0.01mol/L pH9.5 碳酸盐缓冲液中透析过夜。（2）将四甲基异硫近氰酸罗达明（每毫克IgG加入520卩g）溶于二甲亚砜（1mg/ml ）,取此溶液300卩l，一滴一滴加入蛋白质溶液中，同时电磁搅拌。（3）在室温中搅拌2h，避光4 ）把结合物移入直径 3 cm, 高 30cm 大小的 Bio-Gel P-6 层析柱(用 0.01mol/L pH8.0 的 PBS 平衡过），流速为 1.5ml/min（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4C保存备用四）藻红蛋白标记抗体的方法1 巯基化藻红蛋白（ phycoerthrinPE)的制备，600卩的15.5mg/ml 盐

52、酸巯醇亚胺( iminothiolanehydrochloride )加到1.2ml 的 3.6mg/ml 的 PE 中，和 1.2mlPB 、pH6.8 混合，装入透析袋置入 50mmol/LpH6.8 PB中透析，4°C过夜，再换用pH7.5PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基。2PE-IgG 制备 异双功能试剂 SPDPN-Succ - inimdyl 3-(2- pyridyldlthio) propinate 30卩 l(1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入 700卩啲4.2mg/mlIgG PB 溶液( 50mmol/LpH7.5 )，在室温中反应 2.5h。再加入巯

53、基化 PE400 11 l 1.7mg/ml )加到500 gl反应混合液中，室温反应12h，加入100 gl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用PB透析过夜，4C。加入0.01%Na3N3分装，4C保存半年。(五)PE-标记蛋白A方法1）取 4.08mgPE 溶于 0.1mol/L pH7.4PB （含 0.1mol/LNaCI ） 1ml中，溶解后，取出 0.5ml，再加入10卩ISPDP无水甲醇液（2.65mg/ml ） ,SPDP/蛋白摩尔比为10， 22 °C 反应 5min，过 SephadexG-50（1 x 17cm）,用 100mmol/LpH7.4 PBS （含 0.1mol/LNaCl ）平衡和洗脱。（2） 0.5ml 蛋白（ 2mg/ml ） 100mmol/LPB（含有 100mmol/LNaCl） pH7.4，加入 2.6 卩止述 SPDP 甲醇液，SPDP :蛋白=9.5,22 C ,40min，加入25卩mol/L二硫苏糖醇（DTT ） pH7.4缓冲液，22 C，25min，同上过 SephadexG-50 ，收集蛋白 A 峰。（3 ）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22 C反应6h，混合物4C保存备用。以上两种 PE 标记制品，可最后溶于 0.01mol/LpH7.4PB（ 含有 0