瘦肉精检测方法的研究进展

1、 毕业设计（论文）题 目： 瘦肉精检测方法的研究进展 学 院： 专业班级： 指导教师： 职称： 学生姓名： 学 号： 前 言上世纪80年代初，美国脂胺公司的研究人员意外地发现，将一定量的盐酸克伦特罗添加在饲料中，能够改变营养物质的代谢途径，促进动物肌肉特别是骨胳肌蛋白质的合成，同时对脂肪合成有一定的抑制作用，从而可以促进动物生长，增加瘦肉率，并根据一定试验得出，如果在饲料中添加适量的盐酸克伦特罗，可以提高饲料转化率、生长速率、胴体瘦肉率10以上。所以，当时认为这是一种不可多得的饲料药物添加剂，并在世界各地进行推广应用，而我国也于80年代后期，在一些大专院校、科研院所进行了研发试验和推广试验，经

2、过证明其作用效果十分明显，并把盐酸克伦特罗简称瘦肉精。虽然这种饲料添加剂一直没有得到国家主管部门的认可，但是在利益的驱使下，我国许多地区的饲料加工企业和养殖户都开始推广应用。到了上世纪90年代，由于瘦肉精在动物体内吸收快分布广、脂溶性高，具有残留性积累和半衰期长等药理特性，人食用残留盐酸克伦特罗肉品后对肝、肾等内脏器官会产生毒害作用，出现心悸、头痛、目眩、恶心、呕吐、心率加快、肌肉振颤等症状，严重者甚至死亡。盐酸克伦特罗引起的中毒事件不断发生.对人类健康造成的危害和对生态食物链所造的破坏已经引起国内外高度的重视。所以，寻求一种准确、快速的检测方法很有必要。目前，检测瘦肉精的方法主要有四种，即高

3、效液相色谱法（HPLC）、气相色谱一质谱法（GCMS）、毛细管区带电泳法（CE）和免疫分析技术（IA）。而我国结合自己的实际情况，2001年农业部首先组织制定了饲料中盐酸克伦特罗的测定标淮。该标准选择确定了两种：即高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱法（GCMS）。其中将HPLC法作为检测瘦肉精的半确证性方法，GCMS法定为检测瘦肉精的确证性方法。第1章 绪 论1.1 什么是瘦肉精瘦肉精，顾名思义就是一种可以用来提高瘦肉率的药物，它的学名叫“盐酸克伦特罗（CLBenbuterol，Spiropent，Planipart，CLB）”，瘦肉精是一种2受体激动剂，上世纪80年代初国外曾用于饲料添

4、加剂，后因人的不良反应而被禁用。国内养猪户不顾农业部的规定，为了使猪肉不长肥膘，在饲料中掺入瘦肉精。猪食用后在代谢过程中促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高了猪肉的瘦肉率，因此称为瘦肉精。1.2 盐酸克伦特罗的性质1.2.1 盐酸克伦特罗的化学性质盐酸克伦特罗的化学名为“2(叔丁氨基)甲基4氨基3，5二氯苯甲醇盐酸盐或羟甲叔丁肾上腺素”，药品名为“克喘素、舒喘宁、双氯醇胺”等，俗名“瘦肉精”。它是一种从天然儿茶酚胺衍生合成的化合物，分子式为C12H18Cl2N2OHC1，分子量为313.7，熔点为174175，无色或(类)白色微结晶粉末，无臭，味苦，具有调节动物神经兴奋及其体内营养素重分

5、配的功能。易溶于水、甲醇、热乙醇，微溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯和乙醚，其化学性质稳定，高温不易分解。由于它化学性质稳定，耐受高温，畜产品一旦携有，常规烹饪方法和过程如煮沸100、烧烤和微波处理等对其残留不起破坏作用，也不能使其失活、溶解、熔化、损耗或清除它，因而不能消除毒性，人食用后易发生中毒，而且在血液中有很长的生物半衰期、很高的生物利用率和很低的排除率，因此其残留危害也更大。盐酸克伦特罗不仅会对动物造成损害，对人也会带来极大的危害性1-2。1.2.2 盐酸克伦特罗的药理作用盐酸克伦特罗临床上用于急救、治疗哮喘、粘膜充血、止血、过敏反应和妇女产后因子宫收缩引起的剧痛等。在畜牧业上用于

6、提高动物的生长速度及胴体瘦肉率，因此，又称之为“生长促进剂”和“营养重分配剂”，俗称瘦肉精3。其药理作用主要体现在以下几个方面：可作用于气管平滑肌细胞的2受体，使平滑肌松弛，支气管扩张，从而达到平喘作用；可作用于骨骼肌慢收缩纤维上的2受体，使之加速收缩，表现为手不能握住，走路困难，面颈部骨骼肌震颤；可使血糖升高，胰岛素分泌增强，引起厌食；促进钾离子进入细胞，血液中钾离子浓度下降，引起低钾血症，导致心律失常；能引起血乳酸丙酮酸升高，并可出现酮体，引起代谢紊乱，糖尿病人可引起酮中毒和酸中毒；调节机体物质代谢，加强脂肪分解，促进蛋白质合成，实现动物的营养再分配，加快禽畜生长速度，使动物瘦肉率增加9%

7、16%，骨骼肌脂肪降低8%15%；对子宫及尿道平滑肌也有舒张作用；抑制肌肉萎缩的作用；神经保护作用；并对机体的运动能力有影响。1.3 瘦肉精的发现上世纪80年代初，美国脂胺公司的研究人员意外地发现，将一定量的盐酸克伦特罗添加在饲料中，能够改变营养物质的代谢途径，促进动物肌肉特别是骨胳肌蛋白质的合成，同时对脂肪合成有一定的抑制作用，从而可以促进动物生长，增加瘦肉率，并根据一定试验得出，如果在饲料中添加适量的盐酸克伦特罗，可以提高饲料转化率、生长速率、胴体瘦肉率10以上。所以，当时认为这是一种不可多得的饲料药物添加剂，并在世界各地进行推广应用，而我国也于80年代后期，在一些大专院校、科研院所进行了

8、研发试验和推广试验，经过证明其作用效果十分明显，并把盐酸克伦特罗简称瘦肉精。虽然这种饲料添加剂一直没有得到国家主管部门的认可，但是在利益的驱使下，我国许多地区的饲料加工企业和养殖户都开始推广应用，并称其为“瘦肉精”。1.4 瘦肉精的危害1.4.1 瘦肉精的残留性由于盐酸克伦特罗在动物生产中有明显的促生长和提高瘦肉率的作用，受此利益驱使国内外CLB在养殖业中滥用问题非常严重。又盐酸克伦特罗在动物体内具有吸收快、分布广、脂溶性高、具有残留性积累和半衰期长等特点。在动物体内的蓄积与其药量和给药持续时间有关，随停药期的延长逐渐下降，其代谢率较低，不宜大量代谢排出，残留量较高。因盐酸克伦特罗在生产中的用

9、量是治疗量的510倍，而且持续添加时间(3周以上)和在体内消除半衰期(2539h)都很长，所以极易在动物组织中蓄积残留1。在机体的各个组织中，盐酸克伦特罗在眼和毛发中残留的浓度最高，如眼中盐酸克伦特罗残留量比血浆中浓度高107倍。原因是盐酸克伦特罗对不同组织有选择性，首先选择有色素沉着的眼组织和毛发组织沉积，且在眼组织中主要结合在有色素沉着的视网膜和脉络膜上，而在无色素的眼的其他部位则蓄积较少。除了眼和毛发，其他器官的残留情况是：肺、肝、肾约为血浆浓度的2090倍，肌肉和脂肪为315倍。如果在屠宰前没有休药期，则残留量将更高。在动物体内的残留依次为：视网膜、脉络膜（眼睛）、毛发肝、肾、肺肌肉组

10、织、脂肪组织4。1.4.2 瘦肉精对人类的危害虽然盐酸克伦特罗的毒性并不是很强。小鼠、豚鼠静脉注射的半数致死量分别是每公斤体重27.6 mg和12.6 mg。但是由于它的半衰期长，在体内代谢慢，极易蓄积残留于动物体内，在动物肝脏中CLB平均浓度可达45 mg/kg，也就是说，按临床最高治疗剂量每天0.8g/kg计算，人食用100 g被盐酸克伦特罗污染的动物肝脏摄人体内的盐酸克伦特罗就相当于一次治疗剂量的10倍以上，因而极有可能通过食物链使人体中毒而对健康构成威胁。自上世纪80年代中期欧美国家发现瘦肉精的毒副作用以来，至今世界范围内已有数以千计甚至万计因食用残留有瘦肉精的动物源食品而中毒的人员。

11、人食用残留有盐酸克伦特罗的畜产品后表现为肌肉兴奋性增强，有的人中毒后表现为肌肉震颤，重症者腓肠肌痉挛；同时引起心肌收缩加强，心率加快；对高血压患者危害更大，盐酸克伦特罗分解脂肪成游离脂肪酸进入血液，使血管壁弹性降低，引起血压升高，微循环血管膨胀，压迫刺激周围的神经，引起头痛头晕；引起人内脏横纹肌和平滑肌兴奋性增强，表现为呕吐和腹泻；又因体内K+ 、Ca 2+、Na+ 和Mg2+等浓度的平衡破坏，导致细胞膜生物电位去极化能力增强，复极化能力减弱，细胞膜对离子通透性改变，心电图可呈“T波倒置或底平”，ST段下移等，若患者发生死亡，则死于心脏舒张期或心肌梗死。盐酸克伦特罗中毒的患者群中，对患心、脑血

12、管疾病、糖尿病、甲状腺亢进、青光眼、前列腺肥大者可造成威胁生命的恶果。孕妇中毒又可导致癌变、胎儿致畸的严重危害性1。1.4.3 瘦肉精可引起急性中毒和慢性中毒急性中毒一般是在食用含瘦肉精较高的动物组织后15min6h内出现症状，持续90min2d。何松岳等对48例中毒者临床分析发现，病人主要表现为头痛、头晕（54.2%），四肢震颤（95.8%），肌肉酸痛（75%），多汗（47.9%），胸闷（52.1%），心悸（54.2%）。可见，出现死机震颤症状的患者比例最高，肌肉酸痛次之，约一般的患者出现头痛、头晕、多汗、胸闷、心悸等症状，并无明显年龄、性别差异、目前，没有发现患者死亡的现象。慢性中毒可引起

13、心血管系统和神经系统疾病。主要表现为心肌收缩加强，心率加快；血管壁弹性降低，血压升高；微循环血管膨胀，压迫刺激周围的神经，引起头痛、头晕；内脏横纹肌和平滑肌兴奋剂增强，表现为呕吐和腹泻；发生代谢紊乱，细胞膜离子通透性改变。神经另有研究发现，其慢性中毒可引发染色体畸变，诱发恶性肿瘤4。1.5 瘦肉精的防治措施 1.5.1 欧美各国的防治措施早在20世纪80年代中期、欧美各国已发现盐酸克伦特罗的毒副作用。西班牙、意大利、法国等欧美国家有关中毒的报道频繁见诸于国际传媒。早在20世纪80年代初,美国的食品药品监督管理局( FDA)和世界卫生组织(WHO)就明文规定盐酸克伦特罗的最高残留量（MRL）标准

14、为：肉0.2g/kg、肝0.6g/kg、肾0.6g/kg、脂肪0.2g/kg、乳0.05g/kg。部分欧盟成员国如英国规定可食性组织中MRL值为0.5g/kg，荷兰规定牛、马肝脏组织中MRL值0.5g/kg。欧盟成员国已将盐酸克伦特罗残留作为肉品进口必检项目，因而这也成了WTO成员国之间进行国际贸易的技术壁垒。由此可见，盐酸克伦特罗的非法使用及残留不但严重地威胁着消费者的健康，而且也影响着一个国家的对外贸易和声誉。1.5.2 我国采取的防治措施我国自1996年起至今年3月，香港特区及广东、广州、上海、北京、重庆、杭州、苏州、福建、泉州等部分省市因食瘦肉精发生群体性中毒事例屡有发生，引起有关部门

15、的高度重视，20年来相继出台多项的防治措施。国家农业部早在1997年3月就严令禁止2受体激动剂在畜牧养成殖业中的应用。1999年起又在全国范围内开展瘦肉精等违禁兽药、饲料的专项查处。2001年初又颁布强制性行业标准:MY438 2001饲料中监酸克伦特罗的测定明文规定瘦肉精残留量。并确定两种测定方法:高压液相色谱(HPLC)测定方法和气相色谱质谱联用(GCMS)确定法。前者带有半确认性质：测定快速、简便。其最低检测限量为0.05mgkg。后者则具有足够的监测灵敏度，其最低检测限量为0.01mg/kg。主要用于最后确认与仲载。该标准的发布为全国查处非法制售和使用CLB提供技术标准。卫生部起草的国

16、家标准规定检测限量：尿液为0.5 mg/kg,肉类产品为1mg/kg。中国肉类协会于2002年2月发出关于严禁制售“瘦肉精”猪肉流入市场的通知以行业协会名义强化线管理。加大执法力度发布“两院”公告。2002年8月16日,我国最高人民法院审判委员会、最高人民检察院检查委员会联合发布公告关于办理非法生产、销售、使用禁止在饲料和动物饮用水中的药品等刑事案件具体应用法律若干问题的解释中明确规定，非法生产、销售盐酸克伦特罗等禁止在饲料和动物饮用水使用的药品,以非法经营罪、生产销售有毒有害食品罪追究刑事责任，公安司法的加入使执法力度更大1。我们应借鉴美国、欧盟等国家在动物产品生产和食品工业上实施的良好生产

17、规范(GMP)、危害分析与关键控制点(HACCP)和全过程质量控制(IKB)等管理经验，并结合我国动物产品生产的特点。引入全过程质量控制的新理念，加强养殖、屠宰加工和销售环节的质量管理，减小甚至消除CLB残留造成的危害。1.6 本研究的目的及内容1.6.1 课题研究的目的意义盐酸克伦特罗是种饲料添加剂，由于其可促进动物生长，增长瘦肉率，虽然对人有很大的危害，但是在利益的的诱惑下，仍有人违法使用，故需要快速准确的检测方法来检测盐酸克伦特罗。本研究的目的是探讨各种检测方法的的步骤和优缺点，并研究检测方法的未来发展趋势，希望对瘦肉精的检测有参考价值。1.6.2 课题研究的内容本课题主要从以下几个方面

18、进行研究:介绍检测瘦肉精的主要四种方法：即高效液相色谱法、气相色谱质谱法、毛细管区带电泳法和免疫分析技术，以及未来检测方法的发展趋势生物传感器技术、生物芯片技术。第2章 瘦肉精的检测方法目前，已经有多种技术可以对盐酸克伦特罗进行较为灵敏的检测。主要有感观检验法；色谱技术，包括高效液相色谱(HPLC)、气相色谱、凝胶渗透色谱等；波谱与色谱联用技术.如气相色谱一质谱联用技术(GCMS)、液相色谱一质谱联用技术(LCMS)；免疫分析技术，包括放射免疫分析技术(RIA)、酶联免疫技术(EIA)、滴金免疫技术(DIGFA)；电化学技术，包括修饰电极技术、生物传感器技术(BS)、高效毛细管电泳(CE)等。

19、检测瘦肉精的方法主要有四种，即高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱一质谱法（GCMS）、毛细管区带电泳法（CE）和免疫分析技术（IA）。而我国结合自己的实际情况，2001年农业部首先组织制定了饲料中盐酸克伦特罗的测定标淮。该标准选择确定了两种：即高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱一质谱法（GCMS）。其中将HPLC法作为检测瘦肉精的半确证性方法，其最低检测限为0.05g/kg，优点是检测精确度高，而且假阳性率低；缺点是检测过程烦琐、检测时间长，需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。而GC一MS法优点是能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析。GCMS法与HPLC法相比，检

20、测灵敏度更高，假阳性率更低，已将GCMS法定为检测瘦肉精的确证性方法。GCMS法的缺点同HPLC相似。2.1感观检测法凭人的感觉器官对商品的外观特征进行判断，可用于克伦特罗的粗略判断，主观性强，但可为消费者购买提供一定的参考。屠宰前，当猪皮肤光洁、白里泛红、背毛少而松软、臀部结实上翘、腹部匀称、无下坠感且背部体表经驱打后易见伤痕，可怀疑摄入克伦特罗；当猪卧地不起或行走不灵活，易发生跛行或在运输中前后肢易发生开叉，蹄部易受伤并发生其他感染剧烈运动易造成死亡时，可怀疑摄入克伦特罗。屠宰后，如果肉色泽鲜红、松软、后臀肌饱满突出、脂肪层非常薄，肉皮紧贴着瘦肉，瘦肉纤维比较疏松、肉皮与瘦肉之间无肥肉（肥

21、膘厚度不到1.5cm），有时有少量汗水渗出肉面。酮体两侧腹股沟脂肪层毛细血管分布密集、甚至充血，可怀疑含有克伦特罗1,4,5。2.2 高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱(HPLC)是近年来迅速发展起来的新颖、快速的分离分析技术，适于分离生物医学大分子和离子化合物、不稳定的天然产物、种类繁多的其他高分子及不稳定化合物的检测。盐酸克伦特罗做HPLC分析时不需要衍生，利用2肾上腺素能激动剂分子可与C18或C8固定相分子相互作用，应用反相柱检测2激动剂类物质。HPLC在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱（MS)等系统联用，实现分析过程的自动

22、化。所用检测器有电化学检测器、紫外检测器、质谱检测器和二极管阵列检测器。2.2.1 电化学检测器电化学发光分析法是近年来发展较快的一种发光分析方法，已广泛应用于许多无机物和有机物的分析测定。它除了具有传统化学发光分析法的优点，如灵敏度高、线性范围宽、仪器简单等以外，还具有反应过程控制性强、发光信号易于检测、易于微型化的优点.然而，至今为止，还未见到应用电化学发光分析方法来检测盐酸克伦特罗的报道。我们在研究工作中发现，盐酸克伦特罗对联吡啶钌(Ru(bpy)32+)在0.1 mol/L的Na2HPO4介质中的弱电化学发光信号有较强的增敏作用。据此，建立了一种高灵敏测定盐酸克伦特罗的电化学发光新方法

23、，可用于新型盐酸克伦特罗HPLC检测器或便携式传感器的设计.C.crescemzlto等6用LichroeartRPSB柱子，以乙腈：缓冲液(30：70)为流动相，流速为0.8 mL/min的条件下分析肝脏中的盐酸克伦特罗，处理后的样品用电化学检测器，工作电极设在+800 mV，参比电极为Ag/AgCl，其检测限为0.5g/g。杨志凌等7用Discovery Cl8(5m，4.6 mm i.d.250 mm)色谱柱，流动相为1.7 mmol/L的氯化锂甲酸甲醇(65：1：34)混合溶液，流速为1.0 mL/min.柱温40，电化学检测器工作电位为1.25 V，测定猪肉组织中的盐酸克伦特罗，方法

24、灵敏度高，简便，可用于肌肉、肺脏、肝脏、肾脏及脂肪组织中CLB残留的检测。屈颖娟等8建立了一种检测盐酸克伦特罗的电化学发光新方法。结果表明，在0.1 mol/L的Na2HPO4介质中，以循环伏安为电解方式，联吡啶钌的浓度为1.010-6g/mL时，盐酸克伦特罗对联吡啶钌电化学发光信号的增敏效果最好，在此条件下，该方法对盐酸克伦特罗的线性范围为6.010-79.010-6g/mL，检出限为7.310-8g/mL，相对标准偏RSD为3.9(n=7，c=1.010-6g/mL)。电化学检测器在样品净处理较好时可以得到很好的灵敏度，但它不稳定，重现性差且不能作为梯度洗脱条件下的检测器。2.2.2 紫外

25、检测器(UV)紫外检测器是一种常用的检测器，用于分析盐酸克伦特罗所选用的波长范围为215245 nm。James F9用Watersl503.9mmd的symmetryCl18柱分离，用含有醋酸和醋酸铵的甲醇水为流动相以0.8 mL/min进行梯度洗脱，在245 nm下对肝脏中的盐酸克伦特罗进行检测，灵敏度可达0.3ng/g。康莉等10用水提取猪肉及内脏样品中的盐酸克伦特罗残留，固相萃取净化、浓缩，以二极管阵列检测器测定，方法检出限为1.7 ng/g，回收率在81.091.4 ，精密度为1.37(低浓度)和0.76(高浓度)，该法操作简单，干扰少，宜于推广。紫外检测器价格便宜，最为普及，但其选

26、择性不好，在分离效果不好的情况下易受干扰，且灵敏度不高，该检测器常用于检测组织中高浓度的盐酸克伦特罗，尚未见到用于血、尿中CLB的分析报道。2.2.3 质谱检测器质谱检测器可以大大降低检测限，尤其是二级质谱可以作为特异性检测器，也可以弥补色谱上分离的不足，使得对样品处理的要求也大大降低。A.F.Lehner11用含0.05 甲酸和5 的乙腈水及含0.05 甲酸的乙腈为流动相，在0.45 mL/min的流速下，用2502 mm的Luna phenyl柱子进行梯度洗脱，使用ESIMS/MS检测器进行多反应检测，检测母离子m/z为277，子离子m/z为277、259、204、64的产物离子，氘代的克

27、伦特罗作为内标物(质谱的条件为：源温度为120，锥孔电压为+19 V，碰撞塌压为-16 V)，检测限可达4 pg/mL，这是GC/MS不能达到的。聂建荣等12采用调节pH后，过SCX柱对样品进行净化、浓缩，进入高效液相色谱三重四极杆质谱，使用电喷雾离子源正离子模式检测。建立了以高效液相色谱一质谱(HPLCMS/MS)快速检测动物尿液中的莱克多巴胺和克伦特罗分析方法。样品经SCX柱净化浓缩后，以乙腈-5mmol/L乙酸铵(65：35，V/V)为流动相，采用Kromasil CN色谱柱分离，通过电喷雾(ESI)离子源电离多反应监测(MRM)对莱克多巴胺和克伦特罗作定性和定量分析。在1.0500.0

28、 g/L的范围内线性良好(r0.999)。在0.5、4.0、40.0、80.0、200.0 g/L添加水平下，回收率在89.7103.3，相对标准偏差为2.07.8。检测限(S/N=5)为0.1 g/L。质谱检测器灵敏度高，特异性好，但其价格昂贵，仪器不易普及。 二极管阵列检测器（DAD）GCMS法是定性的最佳手段，但由于仪器昂贵不利于推广使用。应用HPLC法成本低，但低浓度检测时普通的紫外检测器检出假阳性率高。应用光电二极管阵列分光光度技术的二极管阵列检测器(DAD)不但克服了普通紫外检测器的缺点，而且能在线获得色谱分离的三维光谱色谱图，提供丰富的定性定量信息，通过比较被测组分和标准物质的光

29、谱图，便可以判断两者是否为同一物质，因此，二极管阵列检测器是液相色谱中理想的定性手段。刘平年13应用高效液相色谱法结合二极管阵列检测器建立了猪肝中盐酸克伦特罗的定性、定量分析方法。用5 高氯酸溶液酸化提取，SCX固相小柱净化，高效液相色谱(HPLC)法测定猪肝中的盐酸克伦特罗的方法，利用二极管阵列检测器(DAD)定量并辅助定性。该方法的平均加标回收率为79 ，检出限0.01mg/kg。应用二极管阵列检测器对猪肝中盐酸克伦特罗进行定性、定量分析，方法简单高效，设备配置要求低，定性准确度较高，定量满足测量要求，适于实验室大批量样品的测试。目前，我国已将HPLC法作为检测盐酸克伦特罗残留的半确证性方

30、法，最低检测限范围为115 ng。其优点采用等度洗脱的方式，两种化合物达到完全分离，互不干扰，采集一次样品数据只需6.5 min时间。回收率高，检测限低，精密度、稳定性及重现性良好，可以作为相关部门制定标准的依据；缺点是样品处理时间长，检测过程烦琐、难于操作、需贵重仪器，在实际应用中受到一定的限制。2.3 气相色谱质谱法(GCMS)GCMS常用于测定血液及组织中CLB残留。由于GC要求样品有较低的沸点且相对热稳定性，而盐酸克伦特罗的极性大，沸点高，不宜直接用于分析，故测定前要对分子上羟基、氨基等极性基团衍生化，主要有硅烷化和环化衍生两种。Giancarlo Biancotto14用含1TMCS

31、的BSTFA在60下30 min对CLB分子中的羟基进行硅烷化衍生，衍生物用HP5MS的柱子进行分离，程序升温为：100 1 min，20/min升到190保持1 min，再以13/min升到305保持4 min，进样口温度为250，离子源温度为200的条件下用离子肼监测m/z为349、264、266 的产物离子，检测限为0.12 ng/mL。Imad K Abukhalaf15用三甲基环硼氧烷在80左右15 min下环化衍生样品，选择性监测m/z为243、285、245、300的离子，尿及血中的检测限分别为0.15ng/mL和0.2 ng/mL。原理16：样品用盐酸葡萄糖醛苷酶或芳基硫酸酯酶

32、在pH5.2的缓冲液中消化，萃取液用MCX小柱固相萃取净化，分离的药物残留经过双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后，用带有质量选择检测器的气相色谱仪测定。检测标准：采用DB31/T2472000猪尿中盐酸克仑特罗残留量的检测方法。检测步骤：提取：移取5mL猪尿样品于50mL具塞的离心管中，用乙酸调整pH至5.2，加入20mmol的乙酸铵缓冲溶液lmL，加入50L盐酸葡萄糖醛苷酶溶液，震荡、超声15min，于37孵育18h。加入10mL乙酸乙酯异丙醇混合液，震荡15min，用滴管收集有机相。用10mL上述混合液重复提取一次，合并两次提取的溶液于试管中，用氮气吹干。用1mL乙酸铵缓冲液溶解。

33、 用SCX柱净化样品。衍生化：用氮气吹干上述溶液，加入100L甲苯，100L BSTFA，混均。置80 的烘箱中加热衍生1h，冷却后加0.5mL甲苯振荡溶解。用气质联用仪选择离子检测方式检测。GCMS与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低，具有快速、分离效果好、费用较低等优点，能在多种残留物同时存在的情况下可以准确地对某种特定的残留物进行定性、定量分析，中国已将此法定为检测CLB的确证性方法。但其衍生化操作繁琐，成本高，而且气质联用仪目前在国内实验室并未普及，难于开展此项工作2.4 免疫分析法(IA)IA法灵敏高，检测限可达到0.5ng/g甚至更低，一次可处理大量样品，样品处理简单或者

34、不需要处理，成本低，每个检测成本在110元左右。随着新标记物的发展与联合应用、单克隆以及基因工程抗体的应用及免疫放大技术，明显提高检测特异性，可实现分子水平的检测。2.4.1 酶免疫分析法(EIA) 最初用于盐酸克伦特罗检测的EIA技术是一种选择性双抗和异源免疫分析的技术，目前，检测盐酸克伦特罗较高效的免疫分析技术是酶联免疫吸附技术（ELISA)。EIA是继RIA之后发展起来的，由于其简便、灵敏、准确，现已成为一种比RIA应用更广泛的检测方法。最初用于CLB检测的是一种选择性双抗和异源免疫分析，现在主要采用竞争EIA原理。近年来出现了一些关于EIA的其它方法，总体特征是简捷、快速、费用低，已有

35、试剂盒开发出来，应用广泛是英国的Randox Laboratories Ltd和德国的rbiopharm公司的产品。EIA的优点是灵敏度高，操作简便，检测迅速，价格便宜。缺点是仍不能实现现场检测，而且假阳性率高，因此要求样品处理、反应条件要尽可能一致。酶联免疫吸附法(Enzymelinked immunoassay，ELISA)酶联免疫吸附法是检测盐酸克伦特罗较高效的方法，是用酶标记的抗体或抗抗体来进行的抗原一抗体反应，利用免疫学抗原抗体特异性结合和酶的高效催化作用，通过化学方法将植物辣根过氧化物酶(HRP)与CLB结合，形成偶联克伦特罗，然后加入待测克伦特罗，竞争性与克伦特罗抗体结合，洗涤后

36、加底物，由于酶的专一性催化作用，可使原来无色的底物通过水解，氧化或还原反应而显示颜色，根据有色物的变化计量待测克伦特罗的量。Sawaya W N等运用ELISA检测了绵羊尿和眼组织中盐酸克伦特罗的残留情况，最大残留检测限分别为0.272ng/mL和1.5ng/g，但假阳性率较高，检出阳性者需用GCMS法确证。ELISA检测限可达0.05ng/g，最高可达0.003ng/g，目前，英国的Randox Laboratories Ltd和德国的Rbiopharm公司均开发出了检测肉品、饲料中CLB残留的ELISA试剂盒2。中国在应用EIA检测盐酸克伦特罗方面的研究较晚.但近几年取得了明显的进展，据中

37、国预防医学科学院营养与食品卫生研究所信息，此类试剂盒已开发成功。目前国内主要采用ELISA作为筛选法，该法快速、简便，可定性或半定量，只能检查出克伦特罗及其同类药物(肾上腺受体激活剂)的存在，不能确定其各自化学本质，假阳性率高，需用GCMS确证，但该仪器价格昂贵，一般实验室不易普及；另外国内试剂质量不过关，而国外试剂盒较贵，成本大。新开发国产盐酸克伦特罗检测方法属于ELISA，检测灵敏度可达到0.5x10-9。达到农业部监督检测标准(1xl0-9)的需要；且试剂盒采用单克隆抗体技术，在特异性方面优于国外产品。叶妮等对中国兽药监察所研制的试剂盒进行了测试.结果表明该试剂盒与德国rbiopharm

38、公司生产的盐酸克伦特罗ELISA检测试剂盒有相当的可比性；实验结果还表明，ELISA作为盐酸克伦特罗残留量的筛选方法具有操作简便、准确、快速的特点，适用于大量样品的测定；缺点是不能实现现场检测而且假阳性率高17。 放射免疫分析法(RIA) 早在1976年，Kopitar和Zimmer18 就报道用RIA分析肾上腺素能激动剂的放射免疫测定程序和动物组织中盐酸克伦特罗的药理学研究。Delahaut等建立了更为特异的RIA法，其盐酸克伦特罗抗血清与其他p一肾上腺素能激动剂的交叉反应小于10，检测限可达到0.5ng/mL(g)的水平。目前国外已有RIA测定CLB的试剂盒产品，还建立了放射受体分析法。放

39、射受体分析法(RRA)类似于RIA，是通过受体与B兴奋剂结合，基于放射性追踪者(3H 二氢阿普洛尔)和苯胺型兴奋剂之间竞争结合来自血浆膜的受体，可对多种B兴奋剂进行检测，检测限达到2.4ng/mL(g)。用于目前国外已生产出运用RIA测定盐酸克伦特罗的试剂盒产品，还建立了类似RIA的放射受体分析法。RIA具有特异性强、灵敏度高、准确、快速、操作简便、易于标准化等优点；但是必须要先标记盐酸克伦特罗，技术难度大，难于普及；由于RIA需要较昂贵的液体闪烁仪或Y放射仪，且放射性同位素对人员有一定的伤害，废弃物又不易处理，这些都限制了此种方法的广泛应用。国内研究在此方面研究尚属空白。 滴金免疫分析法(D

40、IGFA)金标免疫检测技术是90年代在免疫渗滤法基础上建立的一种快速简单的方法，它是胶体金标记技术与快速免疫斑点结合技术相结合的产物。其关键技术是CLB单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记的单克隆抗体的制备、免疫渗滤装置的制备。该方法具有与ELISA相似的特异性和灵敏性，且快速简便，特别是操作无需任何仪器，不经过特殊训练就可得到正确的结果。DIGFA的关键技术是抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记的单克隆抗体的制备、免疫渗滤装置(如硝酸纤维抗体包被膜)的制备，后3种关键技术已比较成熟，最关键的是制备出特异性强、纯度高的抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体2。目前，DIGFA已成

41、功地实现了现场检测若研制出特异性强、灵敏度高的CLB单克隆抗体，就能开发出具有市场潜力的检测试纸条，检测CLB的滴金免疫试纸条或滴金免疫测试盒可实现CLB的高效现场检测。中国农大和南京农大正积极进行CLB单克隆抗体的研制。原理：过盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗一牛血清白蛋白偶联物(CLBBSA偶联物)竞争结合抗盐酸克伦特罗单克隆抗体一胶体金复合物，使试纸上反应线颜色变化，以判定样品中盐酸克伦特罗的含量。当检样中盐酸克伦特罗浓度低于最低检测水平时，胶体金中的抗盐酸克伦特罗单抗一胶体金复合物与T线上的CLBBSA偶联物结合，T线呈色与C线相近；当检样中CLBE浓度0.5ng/mL时，抗盐酸克伦特罗单抗

42、胶体金复合物与盐酸克伦特罗结合，T线显色比C线浅或完全看不到线，且盐酸克伦特罗浓度越高T线显色越浅，从而作出判定。测定步骤：采集新鲜尿样放于4冰箱中待检，无菌采集的尿样可直接用于检测；尿样中有杂质或沉淀物时，4000转/min离心10min后取上清液进行检测。检测试剂应保存于4冰箱中，检测时从包装袋中取出试剂，并打开后在1 h内尽快使用。用滴管吸取待检样品溶液，滴加3滴于加样孔中，加样后开始计时，在35 min内读取结果16。2.4.4 时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)采用时间分辨荧光免疫分析建立快速、高灵敏度的盐酸克伦特罗(CLB)全自动检测方法。用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替

43、荧光物质、同位素、酶和化学发光物质.标记抗原、抗体、核酸探针等物质。以CLBOVA包被96微孔板作为固相抗原，与游离CLB竞争限量的以Eu3+ 标记的抗CLB单克隆抗体，建立解离增强模式的荧光免疫分析体系检测CLB。当免疫反应发生后.根据荧光强度和相对荧光强度比值.判断反应体系中分析物的浓度。达到定量分析的目的。该方法的灵敏度为0.03ng/mL，批内和批间变异系数分别为2.0和8.9，平均回收率为105.8，与沙丁胺醇、莱克多巴胺的交叉反应率分别为0.96和0.77，结果表明，用TRFIA法检测CLB，该方法具有测量灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广等优

44、点，因此越来越多地应用于疾病诊断、疗效观察等医学研究领域。但在农兽药残留监控方面的应用甚少。因此，采用Eu3+ 标记的抗CLB单克隆抗体，开展了CLB时间分辨荧光免疫分析方法的研究。具有良好的应用前景19。2.5 毛细管区带电泳法(CE)随着毛细管区带电泳技术(CE)自动化操作的实现，由于其具有灵活性高、重复性好、操作简便、所需样品量极少(一般只需几纳升)、许多分离参数如缓冲液的组成和pH值、毛细管的类型以及所使用的电场的波形等都可以调节的优点，CE非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析，为快速、批量分离和分析离子化样品提供了一个很好的选择性手段。黄可龙等19人以羟丙

45、基环糊精(HPCD)作为手性添加剂，采用毛细管区带电泳(CZE)成功分离了克伦特罗(CLBenbuterol，CLB)对映体。研究了CD种类与浓度，缓冲液PH 值及浓度，操作温度等对分离的影响。结果表明，以30mmol/L的HPCD为手性添加剂，50mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(PH =2.5)为缓冲液，分离电压24 kV，操作温度20，可使CLB对映体实现基线分离，其分离度为6.78。对拆分机理也进行了探讨，测定了HP CD与两对映体的结合常数及热力学参数；对CZE定量能力(线性，精度)进行了考察，R和S型的线性相关系数都大于0.998，两者的相对标准偏差(RSD)均低于2.2 %。Gaus

46、epohl C等17应用CE技术检测人尿中盐酸克伦特罗的残留， 最低检测限达到0.5ng/mL，而且精确度、准确度均已符合生物样品中残留物的检测标准。缺点是检测时间较长，不能满足在线检测，仪器复杂，缺乏配套的检测器，目前使用范围不广。尽管CE分析样品还存在着一些亟待解决的问题，如目前尚缺乏合适的、配套的检测器等，但是其仍具有较高的研究价值和应用前景。2.6 生物传感器技术(BS)生物传感技术是当今世界上倍受关注的一门综合性很强的技术领域，是“迈向21世纪的医学检验技术”之一。所谓BS即由生物活性物质作为敏感元件，即生物识别系统感受器，再配上适当的换能器及输出显示装置所构成的分析工具，其原理为分

47、子识别部分与被识别物质相接触，将生物技术与微电子技术相结合，利用生物体内抗原、抗体专一性结合而导致电化学变化设计而成的免疫传感器，实质上也是一种电化学传感器。可发生化学变化、热变化、光变化以及直接诱导电信号，即将激素的单克隆抗体微型化膜(感受器或分子识别物)固定于换能器(如工作电极)表面，测定时在待测的激素溶液中加入已知浓度经酶标记的激素、待测抗原与标记抗原竞争性地结合电极上的抗体，使经洗涤后的电极与底物溶液接触.标记酶催化底物发生相应的化学变化，而后利用电学测量方法进行检测、控制及显示输出直接显示测得残留物的含量或浓度值，从而成倍的突破了微量检测的“极限”，大大加快检测过程，使得全自动无试剂

48、检测成为可能21。国外已有生物传感器技术检测CLB残留的报道，最早研制成功的是1967年Updike等研制的葡萄糖传感器.它是一种酶传感器。Pizzariello Andrea应用分子印记聚合膜(MIP)作为分子识别系统，选择固相基质复合电极（SBMCE)作为换能器，微分脉冲电压电流表(DPV)作为输出显示装置检测牛肝中CLB残留，证明此方法特异性强，与其他同类物质交叉反应低，但反应时间较长，灵敏度还有待于提高。肖红玉等利用生物体内抗原抗体专一性结合而导致电化学变化的原理设计成了免疫生物传感器，线性范围为0.18.1g/L，检出限为0.1g/L。通过对100个已知阳性样品和100个已知阴性样品

49、的测试，准确率为97 ；通过对批内和批间的多个重复，仪器的稳定性和重现性都较好，检测时间在20min以内，检测成本低，可以满足现场检测的需要22。酶标免疫传感技术是酶标免疫技术与光电分析技术相结合而产生的一种电化学免疫分析技术，是利用生物传感器进行免疫测定的一种实验手段。其特点是利用酶的化学放大作用，通过测定抗原或抗体标记酶作为示踪酶，将酶与底物反应的化学变化用换能器转化为电信号，从而输出待测物质的含量。目前酶标免疫传感技术的灵敏度可达0.0lng/g，而且可在几分钟之内完成检测全过程，比ELISA法更灵敏、更简便和快速。而且可用于各种抗原物质的测定，尤其对体液中的药物和激素的检测更为适用。所

50、以。如果研制成功测定盐酸克伦特罗残留的酶标免疫传感技术.则可使盐酸克伦特罗的监测及检测工作变得简单、高效。国内未见有开发成功的相关报道17。2.7 生物芯片技术生物芯片的一个突出优点是能平行快速分析上百个或数千个多态性样品.如农产品中农药和兽药残留的检测、微生物的检测和动植基因突变的检测等，都可以通过生物芯片和生物传感器来实现。程京博士提出的微阵列芯片技术具有快速、准确、灵敏、高通量和适用范围广等特点，可为兽药残留的控制提供科学、准确、公证的检验数据。北京博奥生物芯片有限责任公司已开发基于免疫原理的蛋白质芯片和配套的通用样品制备方法及装置，该芯片可用于重点兽药残留的检测23,24。虽然科学工作

51、者已提出多种检测CLB的方法，但都不够理想。上述几种CLB残留检测方法中，HPLC、GCMS、CE的最低检测限都在0.01 mg/kg以上，而且检测过程繁琐，难于操作，不能实现现场检测；EIA法灵敏度较高，但假阳性率也高，只能作为“筛选法”。金标免疫检测技术(DIGFA)和生物传感技术(BS)是现在新发展的两门能精确检测残留的技术，可以克服上述方法的缺点，使盐酸克伦特罗的监测和检验变得简单、高效，并且从定性和定量两个方面实现CLB残留的现场监测，所以研制和开发测定CLB的DIGFA试纸条和生物传感器是完成CLB残留监控规划较为理想的方法和途径，值得深入探讨和开发。2.8 微悬臂梁传感测量法微悬

52、臂梁传感是在原子力显微镜和微机电系统出现后迅速发展起来的一种新型传感方法，在生化传感中有着很好的应用前景。研究发现，当微悬臂梁的单侧表面(一般为镀金面)有分子吸附或生化反应发生时，微悬臂梁的表面应力会发生变化，由于微悬臂梁上下表面化学性质不同，其上下表面应力会产生一个差值，从而导致微悬臂梁产生弯曲变形，利用光杠杆原理可以检测微悬臂梁的弯曲变形。近年来, 这项新型技术应用于分子自组装、蛋白质分子构象转变、DNA双链杂交、癌症检测和转录因子等方面的研究。黄渊等25将巯基化的瘦肉精抗体通过自组装修饰到微悬臂梁的金面，在加入不同浓度的瘦肉精标准样品的过程中，通过光杠杆原理监测微悬臂梁的实时弯曲信号。巯

53、基化瘦肉精抗体的活性和微悬臂梁上抗原抗体的结合得到酶联免疫吸附( ELISA)实验的验证。该系统能够检测至少1 g/L浓度的瘦肉精标准样品,而且具有很强的选择性，在对照实验中加入不含瘦肉精的1 mg/L氯霉素溶液没有响应。另外，瘦肉精抗原抗体的结合导致微悬臂梁产生压应力，而且微悬臂梁表面应力的改变与样品浓度的对数成线性关系。我国在CL检测技术方面较为落后，快速检测基本上依赖价格昂贵的进口试剂盒，若能研制开发出国产的高效、方便、稳定的CL检测试纸条和试剂盒，降低检测成本，具有潜在巨大的市场需求和市场价值，既适应了我国现代化经济发展的需要，也是我国加入WTO，与国际接轨的要求。随着我国经济的快速发

54、展，人们的消费习惯与食物结构都发生了很大的变化，食品安全的重要性日趋显现，关注食品安全就是关注生命，近年来人类食用含有盐酸克伦特罗残留的肉食所致的中毒事件越来越严重，已成为重大食品安全问题；此外，我国进入WTO之后，由于卫生条件和药物残留等问题，导致禽肉产品出口欧盟屡屡受阻，为此应加强残留监测检验，保证我国经济建设的顺利进行，增加经济效益和社会效益，提高我国在国际上的政治地位和综合国力。参考资料1 张清安,范学辉动物性食品中盐酸克伦特罗(瘦肉精)残留危害及其检测方法研究进展J食品与发酵工业,2004,30(9):1091022 米建萍盐酸克伦特罗检测方法的研究进展J中国卫生杂志,2008,18

55、:10123 刘国艳,柴春彦如何全面认识“瘦肉精”J动物科学与动物医学,2002,19(6):l34 张彩霞,董相军瘦肉精研究综述J养殖与饲料,2007,1:57585刘维红动物产品中盐酸克伦特罗残留危害及检测方法J安徽农学通报 ,2009,15(23):1681706 C Crescenzl,S Bayoudh,PAG Cormack,etcDetermination of clenbuterol in bovine liver by combining matrixsolidphase dispersion and molecularly in tinted solid phase ext

56、raction followed by liquid chromatography/electraspray ion trap multiplestage mass spectrometryJAnal Chem,2001,73:217121777 杨志凌,陈杖榴,方炳虎,等高效液相色谱一电化学检测法测定猪组织中的克伦特罗J色谱,2003,21(3):245247 8 屈颖娟,郑行望,章竹君等盐酸克伦特罗的电化学发光检测器的研究J陕西师范大学学报,2004,32(3):66329 James F Lawrence,Cathie MenardDetermination of clenbuterol in beef liver and muscle t