生物工艺原理实验指导学时VIP

1、生物工艺原理实验指导西北民族大学生命科学与工程学院实验一 土壤放线菌的分离培养【实验目的】1. 掌握放线菌的生长特性；2. 掌握土壤中放线菌分离的方法。【实验原理】放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都

2、可以使细菌、霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其他杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，分离纯化后得到放线菌的纯菌株。放线菌菌落一般为圆形，菌落质地致密表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，呈地衣状。放线菌可以产生抗生素，抑制其他细菌及真菌的生长。放线菌生长缓慢，一般为714d，而细菌及霉菌的生长周期一般为4d天，所以必须在培养基中加入重铬酸钾、制霉菌素、放线菌酮等抑制霉菌和细菌的生长（对放线菌无抑制作用）。【试剂和器材】1.试剂可溶性淀粉、硝酸钾、K2HPO4、MgSO4、NaCl、FeSO4、琼脂。2. 器材高压蒸汽灭菌锅、培养皿、试管、涂布棒、恒温培养箱。【实验方法】1

3、. 高氏一号培养基的配制（1）培养基成分（100mL） 可溶性淀粉2g、硝酸钾0.1 g、K2HPO4 0.05g、MgSO4 0.05 g、NaCl 0.05 g、FeSO4 0.001%，琼脂1.8g，加蒸馏水100mL，调节pH为7.27.4，121灭菌20 min。（2）重铬酸钾溶液的配置 称取0.0.5 g重铬酸钾加入灭菌后（凉至50-60）的培养基中。2. 土样的采集和样品的处理（1）土样采集 选取植被生长比较茂盛的环境取样，土样放在无菌平皿里标记后带回实验室。将平皿置于超净工作台风干。（2）平板涂布取土样1g，加入9mL 无菌水，逐步稀释。取200L，进行10-1、10-2、10

4、-3均匀涂布（每个梯度涂3个平皿）。3. 培养（1）221恒温培养714d。（2）4d后开始间隔24h观察生长情况。4. 结果分析（1）描述放线菌的形态。（2）为什么要加入重铬酸钾？【注意事项】稀释倒平板时涂布要均匀，否则会因密度不均导致菌落生长过于集中，无法充分利用营养实验结果：1、通过对放线菌培养结果观察，我们观察发现放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。放线菌具有泥腥味。还有一点就是放线菌菌落周围琼脂平面会有变形的现象。若稀释平板的稀释度不够，放线菌

5、会被抑制了或者菌落太小，而其他细菌的菌落又太多，不容易找到。2、通过本次实验我们学习并掌握了土壤中放线菌分离的方法。分析讨论：1、在涂布平板前涂布棒要放在火焰上灼烧灭菌，冷却到室温后再进行涂布，否则涂布棒温度过高会杀死放线菌。2、实验必须在超净工作台上进行，防止杂菌污染。3、在土壤采样时，选择植被生长比较茂盛的环境，因为这里往往有较丰富的放线菌存在。实验二 淀粉水解糖含量测定【实验目的】1. 掌握工业生产中使用淀粉制葡萄糖的基本原理；2. 学习和掌握淀粉水解的工艺流程及其测定方法。【实验原理】淀粉是由数目众多的脱水葡萄糖单位(C6H10O5)n，经由糖苷键缩合而成的多糖。由淀粉质原料生产葡萄糖

6、，很早以来人们就采用无机酸（通常为盐酸）作为催化剂，在高温高压条件下使淀粉发生水解反应，转变为葡萄糖。葡萄糖醛基在碱性溶液中可使高价铜还原成低价铜。当高价铜量固定时，被样品中葡萄糖还原后，剩下的高价铜可用标准葡萄糖溶液滴定借以定量样品中的葡萄糖（实际为还原糖总和）。1.水解:淀粉包括淀粉、戊糖、半纤维素（主要指多聚戊糖），用盐酸加水分解转化成还原糖。HCl(C6H10O5)n+nH2O nC6H12O62.中和：将余酸中和至pH 67，在碱性溶液中糖会分解，影响分析结果。3.当斐林氏甲、乙液混合时，生成Cu(OH)2沉淀。CuSO4+2NaOH NaSO4+Cu (OH)2Cu(OH)2再与酒

7、石酸钠作用COONa COONaHC-OH HC-O + Cu (OH)2 Cu +2H2OHC-OH HC-OCOOK COOK糖液滴入后铜盐被还原成红色氧化亚铜沉淀CHO COONa COOH COONa(CHOH)4 HCO (CHOH)4 HCOH +2 Cu + 2H2O + 2 + Cu2OCH2OH HCO CH2OH HCOHCOOK COOK Cu2O+K4Fe(CN)6 + H2O K2Cu2Fe(CN)6 + 2KOHCHO N(CHOH) 4 + + H2O (CH3) 2N S N+(CH3) 2 Cl-CH2OH 氧化型（蓝色）CHO N(CHOH) 4 + + H

8、Cl (CH3) 2N S N+(CH3) 2 -CH2OH 还原型（无色）斐林氏溶液全部被还原后，滴入的糖液便与次甲基兰指示剂作用，将其还原成无色化合物而达终点，为了加速反应，在斐林氏溶液中加入黄血盐，使反应生成氧化铜红色沉淀变成可溶解状态，加速反应，并使终点由原来的蓝色转红色变为淡黄色，便于辨认。此法受操作条件影响很大，如温度高低、沸腾时间长短、pH高低等。为了得到较准确的结果，必须保持操作尽量相对统一。另外，为避免酒石酸钾钠在强碱溶液中还原铜，影响结果，甲乙液必须现用现混。【试剂和器材】1.斐林氏A液：CuSO45H2O 35g，次甲基兰 0.05g溶解后定容至1000mL。2.斐林氏B

9、液：酒石酸钾钠 117g, NaOH126.4g，亚铁氰化钾9.4g，各自溶解后定容至1000mL。3.0.1%标准葡萄糖溶液：于100105烘干恒重而无水的葡萄糖称取1000mg加水溶解，并加5mL浓HCl防腐，定容至1000mL。此溶液使用期间如发现浑浊应重新配制。【实验方法】1. 称取1.000g样品（湿淀粉1.500g）置于250mL三角瓶中加100mL水，20%HCl 10Ml，瓶口装一长玻璃管作为回流冷凝用，在水浴上加热3h取出放冷，滴酚酞指示剂，用1mol/L NaOH中和至淡红色，移入250mL容量瓶中定容。2. 预备滴定：各取甲、乙斐林氏溶液4mL于三角瓶中混匀加热至沸腾，滴

10、加0.1%标准葡萄糖溶液至蓝色消失，记下体积数。3. 空白滴定：各取甲、乙斐林氏溶液4mL于三角瓶中混匀，加入比预备滴定少1mL的标准葡萄糖溶液，加热沸腾后，继续用标准葡萄糖溶液滴定至终点。4. 样品滴定：各取甲、乙斐林氏溶液4mL于三角瓶中混匀，加入5mL转化后的样品溶液，用空白滴定的方法滴至终点。5. 计算方法淀粉（%）=（V1-V2）0.10.9=（V1-V2）4.5WW5250 式中：V1空白滴定耗去标准葡萄糖溶液的mL数V2样品滴定耗去标准葡萄糖溶液的mL数W样品重量0.9葡萄糖折成淀粉的换算系数【思考题】（1）缩小测定误差的关键是什么？（2）除了利用酸水解葡萄糖外，还有哪些水解葡萄

11、糖的方法？实验三 原代动物细胞培养与观察【实验目的】1. 掌握原代动物细胞的获取方法；2. 掌握原代及传代细胞培养的基本方法；3. 掌握无菌操作方法。【实验原理】细胞培养是将器官、组织或细胞从生物机体中取出，模拟该器官、组织或细胞在机体内的生理条件，在体外进行培养，使其能够继续生存、生长和繁殖。一些研究结果表明，许多种类的动物或植物的细胞都能在人工培养条件下生存、生长和繁殖。细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响。因为人工培养条件易于改变，并能得到严格的控制，有利于单因子分析。二是细胞培养便于我们对细胞生长、发育过程的观察，可以用显微镜直接观察亦

12、可应用显微缩时电影技术记录其进程。因而，细胞培养是探索和解释细胞生命活动规律的一种简而易行的技术。然而，细胞培养方法也有其局限性，由于培养的细胞生活在脱离了机体的复杂的环境条件下，其生态环境和细胞之间的相互关系都改变了，因此，其细胞生物学性质必然也会发生某些改变。所以在人工培养条件下观察到的结果难于正确反映细胞或组织在机体内部的状况。这一点是我们在应用此技术进行研究时应该注意的。尽管如此，由于细胞培养技术的优点是其他实验方法和技术所不能比拟的，所以近年来，细胞培养技术在分子生物学、遗传学、老年学、免疫学、肿瘤学和病毒学等很多领域都得到了广泛的应用，并取得了很多重大的成果。细胞培养是一种程序复杂

13、而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，供给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要确保在无菌条件下进行。【试剂和器材】1.试剂（1）小鼠肾细胞营养液的配制DMEM培养液 90犊牛血清 10%1万单位/ml青、链霉素 加至约100单位/ml7.4%NaHCO3 调pH至6.87.0(2)平衡盐液Hank液的调节：用7.4NaHCO3调Hank液的pH至6.87.0

14、(3)调胰蛋白酶的pH值0.25%胰蛋白酶溶液中加入数滴NaHCO3充分混匀(pH值为7.67.8)。2.器材解剖剪、解剖镊、培养皿、水浴锅、青霉素瓶、吸管、不锈钢网、血细胞计数板、培养瓶、显微镜、细胞培养箱3.动物 小白鼠【实验方法】1.处死动物在动物细胞培养中，为避免过多血细胞的干扰，一般采用剪断动物颈动脉放血的方法处死动物，然后用水浸湿体表的被毛（或用新洁尔灭溶液）。将动物固定在解剖板上，使其背部向上，先用碘酒棉球消毒背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。 2.取肾在腰部的后缘，用解剖剪提起皮肤，剪开皮肤，将剪开的皮肤分别拉向两边。此时，再换一把解剖剪及解剖镊，剪开背部的肌肉，

15、暴露出腹腔，即可见到肾脏（一般右肾略低于左肾），用弯头眼科镊取出肾脏，置于无菌培养皿中。3.剪肾用眼科剪及镊，将肾膜剪破，并将其剥向肾门，去肾膜及脂肪。再用Hank液洗涤一次，再将洗过的肾脏转入另一培养皿中。另换一把眼科剪及镊，沿肾脏的纵轴剪开，去掉肾盂部分，将肾剪成数块，然后用Hank液洗涤一次。将洗过的肾块转移入无菌的青霉素瓶（或小烧杯）中。用弯头眼科剪，将肾剪成1mm3大小的块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤23次，直到液体澄清为止。4.消化及分散组织块将上步清洗过的Hank液吸掉，按组织块体积的56倍量加入0.25%胰蛋白酶液(pH为7.67.8)。置于37水浴中进行消

16、化。消化时间在15min左右（消化时间的长短与多种因素有关，如蛋白酶的活性及浓度，不同动物及年龄，组织块的大小等等）。每隔5分钟摇动一次青霉素瓶，以便组织块散开，以利于继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。这时可从水浴中取出青霉素瓶，吸去胰蛋白酶液，再用Hank洗涤23次。然后，加入少量营养液，用吸管反复吹打组织块，直到大部组织块均匀分散成均匀的细胞悬液为止，离心。此时，可将分散的细胞悬液经过不锈钢网进行过滤，以除去部分较大的组织碎片。5.计数与释稀从上步滤过的细胞悬液中吸取1ml细胞液，进行计数。将细胞滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释，

17、稀释后的浓度一般为每ml含细胞3050万为宜。6.分装与培养将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般5ml/小方瓶，1ml/青霉素瓶），盖紧瓶塞。在培养瓶的上面做好标记，以免培养瓶放反，并在瓶口处注明细胞，组别及日期。然后放于37条件下进行培养。7.观察置于37培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：（1）培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示已经被污染。（2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高；培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。经过12d的培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意

18、无菌操作，在酒精灯旁，倒去原培养液，再加入等体积的新配营养液，pH7.0。若经23d后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。如果希望细胞长得更好些，此时也可换液，换液时，所用的营养液称为维持液，它与营养液的组成完全相同，仅所用血清为5。以后，每隔34d（视细胞液pH值而定）更换一次维持液。待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养。【注意事项】1. 操作过程中要注意进行无菌操作；2. 可通过将小鼠处死后浸泡于75%酒精中来保证彻底无菌。实验四 乳酸发酵泡菜的腌制及乳酸检测【实验目的】1. 了解乳酸发酵的条件与微生物类型；2. 掌握制作泡菜的基本方法；3. 掌握乳酸发酵的检测方法。【实验原

19、理】在厌氧条件下，微生物分解己糖产生乳酸的作用称为乳酸发酵。自然界中，能够引起乳酸发酵的微生物以细菌为主，这些细菌则统称为乳酸细菌。常见的乳酸细菌多是兼性厌氧菌，包括链球菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属和明串珠菌属的一些成员。它们通常只在厌氧条件下进行乳酸发酵，其发酵产生的乳酸，能够抑制一些腐败细菌的活动。乳酸发酵很早被人们所利用，应用十分广泛。如在畜牧业上常利用乳酸发酵来制造青贮饲料，在食品工业上可利用乳酸发酵腌制泡菜、制作酸奶，在发酵工业上还用纯种的乳酸细菌生产乳酸等。本实验将向大家介绍泡菜制作的基本方法。腌制泡菜多是利用原料上天然存在的乳酸细菌进行乳酸发酵，我们可以通过镜检，初步判断泡菜中微

20、生物的种类。【试剂和器材】1.试剂萝卜、黄瓜、大头菜、生姜、大蒜、八角、料酒、10% H2SO4、2% KMnO4、含氨的AgNO3、食盐、白糖、革兰氏染液。2.器材 泡菜坛【实验方法】1.泡菜腌制（1）将萝卜、黄瓜、大头菜等洗净，连皮切成长方块（注意不要太小），放在架子上晾干；将生姜洗净，晾干。（2）将泡菜坛洗净，用开水烫洗消毒。（3）在烧杯中配制5%的盐水，加热煮沸10min，盖住烧杯，冷却。（4）将晾干的瓜菜放入已消毒的坛中，装量约为坛容积的1/2。（5）将几瓣大蒜剥皮，切成厚片儿，再把一小块晾干的生姜也切成片儿，最后将姜片、蒜片和几个八角一起撒在瓜菜表面或用纱布包好防御菜中间，这样可增

21、加泡菜的风味，并有抑制杂菌的作用。（6）将已冷却的盐水加入泡菜坛中，约至坛高的2/3处，然后加入少许料酒，料酒同样具有增加风味和抑制杂菌的作用。（7）盖上坛盖，并在坛口水槽内加水少许，以隔绝空气。（8）置于30处发酵一周。2.乳酸的检验（1）打开泡菜坛盖，闻坛中有无酸味或异味。（2）取少量泡菜，用pH试纸测定其pH值。（3）吸取10mL泡菜水注入空试管内，加入1mL 10% H2SO4，再加入1mL 2% KMnO4，混匀。此时，试管中如有乳酸则会转化为乙醛。（4）取一滤纸条，在含氨的AgNO3溶液中浸湿，并将其横搭在试管口上。（5）将试管徐徐加热至沸，试管中如有乙醛就会挥发，管口的试纸将会变

22、黑，即可证明泡菜水内含有乳酸。上述变化的化学反应方程式如下：2KMnO43H2SO4 K2SO42MnSO43H2O5OCH3CHOHCOOHO CH3CHOCO2H2OCH3CHO2Ag(NH3)2OH CH3CHOONH42Ag H2O3NH3 3.乳酸细菌的镜检（1） 取一环泡菜水，在载玻片上制成涂片。（2） 革兰氏染色：初染、媒染、脱色、复染。（3） 油镜观察。正常情况下，视野中多为革兰氏阳性的细长杆菌，也常有链球菌出现。【注意事项】发酵期间注意在坛口处补水，以保证坛内的厌氧环境。实验五 三叶草愈伤组织诱导及培养【实验目的】学习并掌握外植体诱导愈伤组织培养方法。【实验原理】植物生长调节

23、剂是诱导愈伤组织形成的重要因素，对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈的刺激愈伤组织的形成。愈伤组织在离体培养过程中，组织和细胞的潜在发育能力可以在某种程度上得到表达，伴随着反复的细胞分裂，又开始新的分化。将脱分化的细胞团或组织重新分化而产生出新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象，称为再分化。在一定的培养条件下，愈伤组织通过分化可以形成苗或根的分生组织甚至是胚状体，继而发育成完整的植株。【试剂和器材】1.试剂NH4NO3、KNO3、CaCl22H2O、MgSO47H2O、KH2PO4、MnSO44H2O、ZnSO47H2O

24、、H3BO3、KI、Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O、Na2-EDTA、FeSO47H2O、甘氨酸、肌醇、盐酸硫胺素(VB1)、盐酸吡哆醇(VB6)、烟酸、细胞分裂素（BA）、生长素（NAA）、蔗糖、琼脂、0.1%氯化汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、三叶草新鲜叶片。2. 器材 超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、棉球、烧杯、容量瓶、细口瓶、广口瓶、培养皿、天平、移液管、高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱。【实验方法】（一）培养基的配制1. MS培养基的配制（1）大量元素母液的配制各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍，用感量为0.01g的扭力天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步

25、混合。后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。倒入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液100ml。 表1 MS培养基大量元素母液制备序号药品名称培养基浓度（mg/L）扩大10称量(mg)1NH4NO3165016500蒸馏水定容至1000ml2KNO31900190003CaCl22H2O44044004MgSO47H2O37037005KH2PO41701700注意：配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药

26、品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。CaCl22H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl22H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl22H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。（2）微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe）组成。微量元素用量较少，特别是CuSO45H2O、CoCl26H2O，因此在配制中分微量、配制。按照表2，表3配方，用感量为0.0001g的电光分析天平称量，其

27、它同大量元素。配制培养基时，每配制1L培养基，取微量10ml，微量ml。表2 MS培养基微量的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大100倍称量(mg)1MnSO44H2O22.32230蒸馏水定容至1000ml2ZnSO47H2O8.68603H3BO36.26204KI0.83835Na2MoO42H2O02525表3 MS培养基微量的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大1000倍称量(mg)1CuSO45H2O0.02525蒸馏水定容至1000ml2CoCl26H2O0.02525（3）铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目

28、前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制培养基时，配制1L取此液10ml。表4 MS铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大100倍称量(mg)1Na2-EDTA 37.33730蒸馏水定容至1000ml2FeSO47H2O27.82780注意：在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成FeSO4和Na2-EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，FeSO4会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，FeSO4和Na2-EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热203

29、0 min)，调pH值至5.5，室温放置冷却后，再冷藏。（4）有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆醇。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。配制培养基时，配制1L取此液10ml。表5 MS培养基有机物质母液的制备序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大100倍称量(mg)1甘氨酸2200蒸馏水定容至1000ml2肌醇100100003盐酸硫胺素(VB1)0.4404盐酸吡哆醇(VB6)0.5505烟酸0.550注意：由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。避免此现象发生的方法是配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。（5）激素母液配制植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般激素母液配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：配制生长素类，例如IAA（生长素）、NAA、2，4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/