感染性疾病的实验诊断

1、感染性疾病的实验诊断感染性疾病的实验诊断浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室杨 青不适当初始抗菌治疗将导致病死率显著提高不适当初始抗菌治疗将导致病死率显著提高不充分初始治疗充分初始治疗A post-antibiotic era is instead a very real possibility for the 21st century-WHO 感染的诊断 感染类型，感染部位 病原体的诊断 获得确切的病原体 耐药性的诊断 耐药菌的种类 耐药机制明确提高抗感染水平的关键提高抗感染水平的关键-正确的诊断正确的诊断感染性疾病的实验室诊断血清学方法分子生物学方法直接镜检法培养法 体外药敏

2、试验病例1 患者男性，33岁，有18年乙肝病史 6.27患者无明显诱因地出现头痛伴发热，体温最高达38.7度，伴全身肌肉酸痛，乏力，胃纳差，恶心 6.30在杭州某医院就诊，血常规：白细胞 7.410E9/L，淋巴细胞3.610E9/L，超敏CRP 10mg/l，拟诊为“脑炎”，建议患者住院行腰穿，患者拒绝 7.1来我院就诊，头颅CT未见异常 7.1血培养：马耳他布鲁菌血培养结果成为诊断的关键采血指徵 发热（38C）或低温（36C）、寒战、呼吸快 白细胞增多（计数大于10，000109/L，特别有“核左移” 未成熟的或杆状核）、CRP升高 皮肤粘膜出血 血压降低、昏迷、多器官衰竭 血 液 病 ：

3、 粒 细 胞 减 少 （ 成 熟 的 多 核 白 细 胞50%) G试验的原理：鲎试验：级联凝固反应 G试验可检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀霉、支顶孢霉、卡氏肺孢子菌，不能检测隐球菌、接合菌 G试验的临床价值： G试验目前主要用于侵袭性念珠菌和曲霉感染的诊断、高危人群的监测以及对疗效、预后的评价 G试验对于区分确诊或拟诊侵袭性真菌感染与非侵袭性真菌感染患者，有良好的准确性 连续检测可动态反应真菌感染程度和抗真菌治疗疗效G因子亚基亚基(丝氨酸蛋白酶原)(1-3)-D-葡聚糖结合丝氨酸蛋白酶比浊法测定比色法测定激活Kdzierska A, et al. Eur J Clin Microbiol

4、Infect Dis. 2007,26:755.GM试验的临床价值 GM试验检测底物：曲霉细胞壁成分半乳甘露聚糖(菌丝在组织生长过程中释放) GM试验可检测曲霉菌属、隐球菌属和青霉/拟青霉 GM试验的临床价值： GM试验目前主要用于侵袭性曲霉感染的诊断、早期、快速、特异性高 半乳甘露聚糖水平的动态变化反应抗真菌药物疗效，指导抗真菌药物使用 推荐用于恶性血液肿瘤患者和造血干细胞移植患者，不推荐用于实体器官移植(SOT)患者美国FDA于2003年批准将检测血清曲霉GM抗原作为侵袭性曲霉感染的诊断指标吕沛华, 等.中国感染与化疗杂志.2006;6(4):284-287临床应用WBC 白细胞计数白细胞

5、计数Endotoxin 内毒素内毒素IL-6 白介素白介素-6IL-10 白介素白介素-10TNF 肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子Procalcitonin 降钙素原降钙素原CRP C反应蛋白反应蛋白Protein CHMG-1sTREM-1.选择合适血清学指标，帮助临床判断感染的类型、严重程度及疗效血清降钙素(CT)的前肽物质分子量：14.5 kDa由116个氨基酸组成的糖蛋白质无激素活性11号染色体上的单拷贝基因转录甲状腺滤泡细胞降钙素原前体内源多肽酶降钙素原 PCT分解细胞内特殊蛋白酶降钙素PCTMller B. et al., JCEM 2001CT 降钙素正常情况下脓毒血症及 促炎症细胞因

6、子Reinhart K, et al. Crit Care Clin 2006;22;503-519快速、高特异性的增长 在脓毒症情况下，3-6小时即可检测到其水平的增长快速衰减 半衰期约20-24 小时 ，可以快速反映治疗效果PCTIL-6CRPMller et al., CCM 2000lactatesMuller et al.,Circulation 2004脑膜炎 血清PCT是区别病毒性脑膜炎和细菌性脑膜炎（CSF直接镜检阴性）最可靠的指标 PCT0.28ng/ml，灵敏度95%，特异性100%，NPV 100%，PPV97%，ROC曲线下面积0.99呼吸道感染(CAP) PCT 0.

7、25ng /ml，作为细菌性肺炎的诊断阈值 PCT0.5ng/ml，严重复杂的感染 PCT0.1ng/ml，排除细菌性肺炎即使有影像学 的改变 指导是否需要进行血培养 PCT0.5ng/ml，菌血症可能性非常大呼吸道感染(VAP)1.540.50.060.030.040.02对于临床评价认为需要抗生素治疗但其PCT值较低（0.25ng/ml）的患者，建议不应使用抗生素对于有极低PCT值（0.1ng/ml）的患者，应强烈禁止抗生素治疗6-24 小時後控制PCT水準可以考慮抗生素:-呼吸道或血液迴圈不穩定-威脅生命的共存慢性病-需要轉入ICU-PCT 3, COPD GOLD 標準第四級以上-PC

8、T IV 或者 CURB 2, COPD 和 GOLD III-局部感染 (膿腫， 積膿)-宿主防禦免疫不全 (例如：使用非皮質激素類免疫抑制劑)-伴隨感染，需要使用抗生素。考慮PCT過程如果已經使用了抗生素:-在第3, 5, 7天的時候重新測量PCT值；-使用上述相同的界點值停止抗生素；-如果一開始PCT水準10 g/l，那麼當PCT峰值下降80-90% 後停止抗生素；-如果PCT持續較高水準，考慮治療失敗（例如抗性菌株，積膿症，ARDS）-門診病人：根據上次PCT結果決定抗生素使用的時間 -0.25-0.5 g/l: 3 天 -0.5 - 1.0 g/l:5 天 -1.0 g/l:7 天念

9、珠菌念珠菌 念珠菌相念珠菌相关关的的脓毒症在大多数脓毒症在大多数情况下，情况下，PCTPCT始终在始终在0.05-20.05-2之间之间起伏起伏曲霉菌曲霉菌 PCT PCT 会延迟会延迟上升上升 大多数情况下大多数情况下,PCT,PCT浓度前期浓度前期在在0.05-20.05-2间起伏，然后会有非常间起伏，然后会有非常明显的升高，浓度甚至可达几十明显的升高，浓度甚至可达几十菌血症念珠菌血症 单单一次PCT检测不容易鉴别细菌感染与真菌感染 连续监测PCT浓度变化，更容易看出真菌感染时的变化规律病因病因降钙素原临界点降钙素原临界点 (ng/mL)(ng/mL)评论评论参考文献参考文献侵袭性侵袭性真

10、菌感染真菌感染 0.5 0.5 后期后期增加，在第增加，在第1-31-3天天, , 敏感性敏感性仅为仅为 53%, 53%, 高峰高峰期敏感性期敏感性90%, 90%, 念珠菌血念珠菌血症症较不显著较不显著; ;曲霉菌曲霉菌的峰的峰值延值延后后Supp Care Can. 2005;13(5):343-6军团军团菌菌0.5 ( 0.5 ( 平均平均 13.5)13.5)敏感性敏感性86.7% 86.7% Clin Microbiol Infect. 2009肺结核肺结核2 (2 (平均平均 4.16)4.16)敏感性敏感性30% 30% 特特异性异性82%, 82%, 建议建议在在HIVHIV

11、患者中使用患者中使用Int J Tuberc Lung Dis.2006 支原支原体体0.5 (0.5 (平均平均 0.2-0.2-0.96 )0.96 )敏感性敏感性20%, 20%, 反应严重反应严重程程度度韓晓华中国当代儿科杂志 2007PCT血中浓度与病程发展呈正相关对于感染程度及器官机能障碍的严重性进行准确的判断(n=109)F. Stber, University Bonn, Lecture at ISICEM, Brussels 2001随着患者对抗生素治疗的响应，引起了PCT血中浓度水平的典型变化过程感染性疾病的实验室诊断血清学方法分子生物学方法直接镜检法培养法 体外药敏试验依

12、据生理生化特征进行鉴定的传统方法面临很多的困难 费时，对于分枝杆菌、厌氧菌等需要更长时间 广谱抗菌药物的使用极大降低了培养的阳性率 苛养和少见细菌感染增加 常规的自动化鉴定仪鉴定菌种范围有限，有时无法准确鉴定到种分子生物学技术在临床的应用 基于基因扩增及测序技术的快速鉴定 蛋白质谱对可培养病原菌的快速鉴定16S rRNA序列测定已成为疑难病原菌检测和鉴定的常用方法 XpertXpert MTB/RIF MTB/RIF核酸检测采用核酸检测采用CepheidCepheid公司公司GeneXpertGeneXpert检测检测系统，是一种半巢式实时荧光定量系统，是一种半巢式实时荧光定量PCRPCR体外

13、诊断技术，针体外诊断技术，针对对rpoBrpoB基因基因81bp81bp利福平耐药核心区间（利福平耐药核心区间（RRDRRRDR）设计引物、）设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否结核探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否结核以及是否对利福平耐药（以及是否对利福平耐药（rpoBrpoB序列存在突变）。序列存在突变）。 可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药 对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单Xpert MTB/RIF分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测（芯片法）病例4 患者男性，72岁，3月前无明显诱因出现咳嗽咳痰，检查“

14、痰找抗酸杆菌+”，“ CT两中肺结核 右下肺、左下肺炎”，当地医院诊断“肺结核”，给予“异烟肼 乙胺丁醇 利福平”抗结核治疗20天后，出现药物性肝损，护肝降酶治疗效果不佳，TBIL进行性升高，2011.4.14 “TBIL275.4umol/l”5.16痰找抗酸杆菌抗酸杆菌？抗酸杆菌？结核杆菌？结核杆菌？非结核分支杆菌？非结核分支杆菌？奴卡菌？奴卡菌？ 痰培养： 16sRNA PCR 证实 为鼻疽奴卡菌痰结核菌培养 基因芯片杂交 结核分支杆菌阴性 鸟分支杆菌阳性鸟分支杆菌的治疗 对异烟肼（INH）及吡嗪酰胺（PZA）耐药 每周三次给药：克拉霉素或阿奇霉素，利福平、 乙胺丁醇，加或不加阿米卡星，

15、治疗6个月Agns Ferroni et al, JCM, 2010A. Bizzini et al, JCM, 2010基质辅助激光解析电离基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法飞行时间质谱法MALDI-TOF MS原理：用特异性的多肽、蛋白质谱进行菌种鉴定优势：快速：20min之内即可得到结果，是现有方法中最快的阳性血培养鉴定法、纯菌株大约10分钟高特异性和敏感性：接近100%对部分混合感染样本的准确鉴定不足：多报道用于鉴定细菌，酵母菌及分枝杆菌需要建立严格的标准数据库体系进行比对分析 应用范围：纯培养菌株、或报警阳性的血培养瓶检测病例5 男性，50岁，因“咳嗽咳痰伴左颊部溃疡3月”入院 病