药品微生物限度检验方法标准操作规程DOC

1、标准操作规程标 题：药品微生物限度检验方法标准操作规程生效日期 年 月 日 页次：1/12编号：SOPQC02801颁发部门：质量管理部 新订 修订原文件号：编制：部门审核：QA审核：批准：分发部门：QC 目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。 范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。责任者：QC主任、化验员。规程：本规程引至中国药典2000年版。1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本

2、文附录一。2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。4. 检查：4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿

3、、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02801 页次：2/124.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为3035，霉菌、酵母菌培养温度为2528，控制菌培养温度为361，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。4.4. 复检. 菌数

4、测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。. 以复试项下不合格项目为准，作单项复试。复试需另取同批号样品，测定2次。 . 复试报告，以3次测定结果的算术平均值报告。4.5. 检验报告. 检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。 . 测定菌数报告，以每次测定结果全部平均值报告。. 控制菌按检验结果报告，如未检出控制菌时，报告为“按规定抽样检验结果未检出XX菌”，如抽样中任意一样品要检出控制菌时，报告为“按规定抽样，检出XX菌，不符合药品微生物限度标准。”4.6. 培养基、试药及稀释剂的相关内容见本文件附录三。4.7. 供试液的制备：按供试液的理化特性与

5、生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。. 供试品的取样及注意事项供试品取样应有一定数量，以使检验结果具有代表性，正常的供试品一般每批应随机抽取两瓶或两盒以上的包装单位，检验时每次应分取两瓶(盒)以上的样品共10g或10ml。供试品在检验前，应严格保持包装的原有状态，不得启开，并放在阴凉干燥处，防止微生物再繁殖，以免影响检验结果，凡已将原包装启开，则无代表性应另取样。供试品稀释后须在12小时内操作完毕，防止微生物繁殖或死亡。供试品稀释成供试液后，应在均匀状态下取样，凡因抑菌或不溶于水的剂型，其供试品应作特殊处理后进行检验。4.7.2. 液体供试品：取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作

6、为供试液。油剂可加适量聚山梨酯80，混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02801 页次：3/12再稀释成100ml作为供试液；合剂（系指含王桨或蜂蜜者，下同）可用供试品作为供试液。 4.7.3. 固体、半固体或黏稠液供试品：称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜的方法混匀后作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45。 （1）非水溶性供试品：取供试品5g（5ml）加入含溶化的无菌司盘805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g

7、混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45左右的0.9%无菌氯化钠溶液约80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（120）。 （2）肠溶胶囊（片）供试品：称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）100ml的锥形瓶内，于45水浴中，保温、振摇，使溶解，作为供试液。 （3）含抑菌成分的供试品照中国药典2000年版附录“微生物限度检测法”制备供试液。 4.8. 对照用菌液 . 控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，大肠杆菌的对照菌株为CMCC(B)44 102，其余对照菌株见中国药典2000年版附录。 取相应菌株的营养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培

8、养1820小时后，稀释至1106。对照菌的加入量为50100个。. 菌种短期保存法：凡使用菌种，一般接种在普通琼脂斜面上，经37培养1820小时，取出在5的冰箱内保存备用即可，每月接种传代一次，数周内不致死亡。 4.9. 检查法 . 检查前的准备： A. 用具的洗涤与灭菌。 试管：使用过的试管经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用纯化水冲洗45次，倒立，晾干备用。灭菌前，用棉塞塞上管口，牛皮纸包紧，扎紧。 标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02801 页次：4/12B. 吸管：使用过的吸管用清洁液浸泡数分钟后，用纯化水冲洗45次，晾干，备用

9、。灭菌前，在吸管上端距0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，用牛皮纸裹紧。 C. 研钵：使用过的研钵用清洁液洗刷后，用纯化水冲洗数次，晾干备用。灭菌前，用牛皮纸将钵体和锤包裹。 D. 培养皿：使用过的培养皿经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗涮，用水冲洗45次，倒立、晾干各用。灭菌前，根据消毒器内经大小用牛皮纸包数个培养皿，扎紧。 将上述包好的用具，放在121的高压蒸汽消毒器中，灭菌30min后，放入微生物限度检查室定点位置，备用。 将所有已灭菌的培养皿、三角瓶、吸管（ 1ml、 l0ml）、稀释剂及供试品等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中人出操作间。将

10、全开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使其工作30min。操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，再用0.1%新洁尔灭或用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口周围，待干后将供试品瓶、盒、袋启封，启封后先检查瓶盖内侧及瓶口周围有无生霉、长螨的迹象，对肉眼可见疑似者，若经证实为生霉、长螨即可判定为不合格，无须继续检验。. 细菌、霉菌、酵母菌计数。4.9.2.1. 检查程序（如下列图1）。. 操作步骤a.供试液制备：经阴性对照联样后，按各类制剂备供试液的方法（见10供试液的制备）制备。b. 稀释及取样 稀释：取1ml吸管1支，吸取混匀的110供试液（或原液，1：2

11、0供试液）1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，测管壁注入装有9ml的稀释剂的试管中，混匀成1100（或110，1200）的稀释液。 吸样：用上述吸管分别取110供试液（或原液，120供试液）1ml，注入23个平皿中，以另一支1ml吸管，按上述操作下一级的稀释与吸取。c. 注皿与干燥标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02801 页次：5/12报告菌落计数供试品110供试液1100供试液11000供试液11000供试液1100供试液110供试液注皿培养（图1）事先将培养融化，置45水浴中，备用，当供试液及各稀释液均注入平皿后，以上述培养基倾注入平

12、皿，每平皿约15 ml ，转动平皿，使样液与培养基混匀后，置水平台上待凝。培养基凝固后，在净化条件下开盖倒置或换灭菌的陶瓦盖，使平板干燥，减少平板表面的水分，防止菌落蔓延生长，干燥时间一般在3h左右，干燥时间计入培养时间。d. 培养：将上述平板倒置于适宜温度的培养箱中，培养。细菌于3035培养482小时，霉菌于2528培养722小时。e. 菌落计数：用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用于510倍放大镜检查，是否遗漏。若平板上有2个或者2个以上的菌落重叠，可分辨时分辨，仍以1个或2个以上菌落计数。标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC0

13、2801 页次：6/12平板上有片状菌落或花斑样菌落蔓延生长以及平板受到污染的情况，该平板计数无效。当同一稀释级使用2个平板时，应采用2个平板菌落数的均值为平均平板菌落数，若2个平板菌落数相差在职倍以上时，该稀释级不宜采用，但不包括2个平板菌数均在15个以下的情况（15个以下两平板菌落数允许幅度04，25，29，412，514，613，714）。f. 菌数报告规则细菌一般宜选取平均平板菌落数30300间的稀释级，作为菌数计算的依据，霉菌宜选取平均菌数在30100之间的稀释级作为菌数计算的依据。若在1个稀释级的平均平板菌落数处于30300（30100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数，为报

14、告菌数。若有2个稀释级的平均平板菌落数处在30300（20100）之间时，按下式计算两级比值。当比值2时，以两级的菌落数均值为报告菌数；当比值2时，以低稀释级平均平板菌落乘以稀释倍数为报告菌数。若有3个稀数级的平均平板菌数处在30300（30100）之间时，采用后2个稀释级计算级间比值。当比值2时，以两级的菌落数均值为报告菌数；当比值2时，以低稀释平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数若各稀释级平均平板菌数均在300以上，按最高的稀释级的平均平板菌落数第六以稀释倍数为报告菌数，或适当增中稀释数，重作测定后报告结果。若各稀释级的平均平板菌落数均不在30300间，其中稀释级的平均平板菌落数大于300

15、，相邻稀释的平均平板菌数又小于30时 ，以最接近30或300的稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。若各稀释平均平板菌落数均小于30小时，按最低稀释级的平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数，但若用原液为供试液，当110稀释级与原液的平均平板菌落数相等或大于时，应以培养基稀释法测定。标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02801 页次：7/12g. 培养基稀释法：取供试液（原液或110，1100供试液）3份，每份各1 ml，分别注入5个平皿内（每皿积压为2 ml），每个平皿倾注营养琼脂培养基约15 ml，混的菌落数，共得3组数据，稀释级平均

16、菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。h. 报告数书写（细菌数报告规则举例）原液供试品稀释倍数级间比值菌落数报告数书写10-1 10-2 10-31365 164 201640016103或160002760 295 461.63775038103或380002890 271 602.22710027103或27000239 202 351.72760028103或28000236 196 421960020103或20000不可计 4650 5135130051103或51000不可计 305 123050030103或3000024 19 1224024101或24022.327 7 2

17、7027101或27006 0 06 10注：(1) 菌落数在100个以内时，按实测数书写报告。(2) 菌落数大于100时，取二位有效数字，第三位数按有效数字处理规格处理，为简便计，也可用不着0的指数报告。(3) 不得按计数规则报告的情况:空白对照平板有菌生长，表明培养基已被污染；各稀释级平板上生产的菌落数不任何10倍递增稀释规律，菌数显示混乱；同一稀释级的两个平板上生长的菌落数均在15个以上，但菌数相关一倍以上；菌落蔓延生覆盖整个平板无法计数；出现以上情况，该次实验数据不得计数报告。. 大肠杆菌检查法；标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02

18、801 页次：8/124.9.3.1. 检验程序（见附页）. 操作步骤标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02801 页次：9/12取胆盐乳糖培养基3份，每份100 ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养1824小时（必要可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种5 ml MUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。供试液的M

19、UG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红者为阳性，呈试剂本色为阴性。当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。供试液MUG阳性，靛基质阳性，判断检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养1824小时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。若有菌落生长，应挑选23可疑菌落作靛基质度验（I）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生

20、成试（VP）、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰染色、镜检，按下表规定判断结果。MUG1曙红亚甲蓝琼脂IMVic结果检出大肠杆菌未检出大肠杆菌无菌生长未检出大肠杆菌有菌生长检出大肠杆菌有菌生长检出大肠杆菌注：、如出现+ + 或出现 + ，均应重新分离菌株，再作MUG1和IMVic试验；为革兰氏阴性杆菌。宝靛基质试验（I）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养24小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，于试剂本色为阴性。甲基红试验（M）：取可颖菌数或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄胨水培基中，培养48小时2小时，于管内加入甲基红指示液数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈

21、黄色为阴性。标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02801 页次：10/12乙酰甲基甲醇生成试验（VP）: 取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖水培养基中，培养小时2小时，于每2 ml培养液中加入a-萘酚乙醇试液1 ml，混匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4 ml，充分振摇，在4小时内出现红色为阳性，无红色反应为阴性。枸橼酸盐得用试验（C）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，一般培养，4872小时，培养基斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变为阴性。革兰氏染色法、镜检：试剂；结晶紫染液：取结晶紫1

22、.0g溶于95%乙醇20ml，与1%草酸铵溶液80 ml混匀静置48h备用。革兰氏碘液，先用35ml蒸馏水溶解2.0g碘化钾，再加入磺片1.0g，待全溶后，加蒸馏水稀释至300ml，备用。沙黄（蕃红）染液：将沙黄0.25g溶于95%乙醇10ml中，待全溶解后再加蒸馏水至100ml，即可。染色法：用接种环沾取无菌水，置于洁净载玻片上，再挑取少许菌苔，轻轻研开，使均匀。涂片自然风干或微热烤干，而后通过火焰23次以固定涂片。滴加结晶紫梁液，染色数分钟，水洗，滴加磺液媒染1分钟，水洗，甩干余水，滴加95%乙醇脱色，约2030秒，水洗，吸干，滴加沙黄复染液，染1分钟，水洗，待干，镜检。染色结果：革兰氏阳

23、性菌呈蓝紫色，阴性菌呈红色。4.9.4. 活螨检查法：a. 设备和材料：显微镜、双筒实体显微镜、放大镜、解剖针、发丝针、小毛笔、载玻片、盖玻片、酒精灯、培养皿或小搪瓷盘（内衬黑色）30%甘油水。b. 螨的形态特征：螨的体表微小，多在1mm以下，一般呈卵圆形或椭圆表、无头胸、腹界限。幼螨足三对，若螨足四对，成螨足多数为四对。足通常由六节组成。口器向前突出，螯肢常呈螯钳状，由23节组成。须肢节数因种类而异，由不得2到5节组成，一般呈爪或钳状，偶尔为长形。有些种类在躯全前端或两侧有12对眼，躯体两侧对称，表面有被有坚硬的几丁质的板，保护其内部器客和支持肌肉固定。体表有刚毛，它的形状、数目及彼此长短比

24、例和排列位置因种类而异。螨类与蜘蛛、昆虫（书虱），外形比较的近似，因此，必须注意它们之间的主要区别，见下表：标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02801 页次：11/12特征成螨（如腐食醋螨）蜘蛛昆虫（如书虱）分类蜘形纲、蜱螨目蛛形纲、蜘蛛目昆虫纲、啮虫目足4对4对3对触角无无1对体段头、胸、腹无界限头、胸、腹无界限头、胸、腹无界限c. 检查方法：直检法：取供试品先用肉眼观察，有无疑似活螨的白点或其它颜色的点状物，再用510倍放大间或双筒实全显微镜检视，有螨者，用解剖针或发丝针或小毛笔挑取活螨放在滴一滴甘油水的载玻片上，置显微镜下观察。漂浮法

25、：将供试品放在盛大有饱和食盐水的扁表称量瓶或适宜的容器内，加饱和食盐水至容器的三分之二处，搅拌均匀，置10倍放大镜或双筒实体显微镜下检查，或继续加饱和食盐水至瓶口处（为防止盐水和样口溢出污染桌面，宜将上述容器放在装有适量甘油水的培养皿中），用洁净的载玻片盖在瓶口上，使玻片与液面接触，沾取液面上的漂浮物，置显微镜下检查。分离法：也称烤螨法。将供试品放在物质特制的分离器或附有孔径大小适宜的筛网的普法玻璃漏斗里，利用活螨避铫、怕热的习性，在漏斗的广口上面放一个60100W的灯泡，距离药品约6cm处，照射12小时。活螨可沿头漏斗内的底部细颈内壁向下爬，用小烧杯装半杯甘油水，放在漏壮举的下口处，收集爬出

26、来的活螨。活螨卵的检验方法：螨卵极小，一般在0.1mm以正是，呈乳白色，椭圆表或卵圆形。须用1020倍入大镜或显微镜方可查见。螨卵常见于活螨的周围，但在未检出活螨的样品中，亦有检出螨卵者。一般在供试品中已经检出活螨的，不再进行螨卵的检查。对可疑供试品，未检出活螨时，可注意检查活螨卵。检验方法：可采用检验活螨项下的直检法或漂浮法检法。凡用上述两种方法检查，如发现可疑螨卵时，用发丝针小心挑取。取一块形载玻片，在窝中央滴入2滴甘油水，将挑取物放入甘油水中，置显微镜下检查为确证挑取物是否为活螨卵，可将上述载玻片置培养皿中，加盖，于2230培养38天，每天上、下午定时用低倍显微镜观察，如在甘油水液中孵出

27、幼螨，则判断为检出活螨卵。标准操作规程标 题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部 编号SOPQC02801 页次：12/12供试品检验报告凡供试品按上述有关剂型项规定检验，发现活螨者，应作检出活螨报告。在供试品中未检出活螨，但检出活螨卵时，可按检出活螨处理。为保留阴性结果备查，可将检出的螨按下法处理保存；半活螨挑放在载玻片上，预先滴有1滴75%乳酸溶液中，加上盖玻片。手持载玻片，在酒精灯小火焰上来回移动，缓缓加热片刻，使其适当透化、即可镜检。鉴定后的螨体，可取下放入70%酒精中保存，或适当处理。发线针的制作：取长约1.5cm的头发丝一根和长约10cm的小金属棒一根，以头发丝长度

28、的一半紧贴在金属棒的一端，用细棉线将其缠紧，然后粘上加拿大树脂或油漆，晾干，即得。5. 内包装材料中不易溶解的（如PVC，铝箔等），取100cm2，剪碎，加入100ml无菌生理盐水，浸泡后振摇，制得供试品溶液，照上述方法检验，结果以10cm2报告，细菌数不得过100个/10cm2，霉菌数不得过10个/10cm2，并不得检出大肠杆菌及活螨。注：本文含有的附件有：无菌操作室的管理及使用制度、设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法、培养基、试药及稀释剂、药品卫生检验记录、附录一：无菌操作室的管理及使用制度1. 无菌操作室内应设有缓冲间，缓冲间内设有紫外灯，并备有无菌操作衣、帽、口罩、拖鞋和

29、消毒用的洗手盆和毛巾等，入室前应严格洗手消毒，穿戴无菌衣帽、口罩、拖鞋。2. 无菌室内应备有超净工作台，专用的接种棒等，以及盛有5%石碳酸水溶液的消毒吸管筒、酒精和碘酒棉球等。无菌操作衣帽应经常热压灭菌。3. 每次进无菌室之前，须用0.1%新洁尔灭擦拭工作台面等，用35%来苏尔溶液拖地面，并须定期用电炉烘烤无菌室内，防止霉菌，定期做杂菌的抽验检查，要求在室内各个角落打开琼脂平板培养基，放置30分钟，经37培养48小时,生长的杂菌菌落数平均应在3个以下。4. 在无菌操作前后，室内应打开紫外灯照射1520分钟，操作完毕后应及时清洁操作室。5. 在进行活菌，毒菌和药品检验操作时，一切器具和用品都应保

30、持无菌，不得用手直接接触或污染他物，防止污染，接种环在使用前后都必须通过火焰，严格施行烧灼灭菌，冷却后，方可使用或收还，吸取菌液时，严禁直接用口吸。附录二：设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法1. 常用消毒液的配制1.1. 0.1%新洁尔灭溶液：称取新洁尔灭1g加水使成1000ml即得，用于擦拭工作台面和手消毒。1.2. 35%来苏尔溶液：取来苏尔3050ml加水使成1000ml即得，用于手或地面的消毒。1.3. 75%乙醇棉球配制：取95%的乙醇原液78ml加水22ml混匀即得，而后将脱脂棉花球泡在内。用于手的消毒。1.4. 2%碘酒棉球的配制：每100ml95%的酒精内先加1.

31、5g碘化钾，微温后振摇使溶解，再加2g碘片，振摇完全溶解后即为2%的碘酒液，将脱脂棉球浸泡于中即得。用于手、皮肤和器械的消毒，注意此液要保存于棕色瓶中。2.玻璃器皿的洗涤2.1. 新的玻璃器皿应先用清水冲去灰尘杂物，沥干水后，浸泡的重铬酸钾硫酸洗液中12小时左右，滤尽酸液，用清水冲洗干净，备用。2.2. 吸过细菌培养基的吸管，用后应立即浸泡在装有5%的石碳酸溶液的吸管筒内，整根吸管要全部浸泡在消毒液内12小时以上，方可取出，立即用清水去污物，沥尽水份，放在铬酸液中过夜，取出清水冲净，烘干备用。2.3. 装有细菌培养物的试管、双碟及吸过含芽孢的强毒菌的吸管，须先经高压灭菌，取出倾出废物，用洗洁精

32、水刷洗，清水冲净，烘干备用。2.4. 用过的载玻片，应随即泡在35%的来苏尔水溶液中，每隔数周集中取出，用洗衣粉水煮沸，洗净，清水冲洗，蒸馏水冲洗12遍后，晾干备用。3. 灭菌器具的准备3.1. 棉花塞：供细菌检验用的各种试管、三角瓶棉塞等均应是普通棉花包一层纱布制成，松紧应适度，长度一般要求是塞进管中约3/5，留在管外约2/5，使用完后随即烘干，防霉防尘，变硬无弹性时应重新更换。3.2. 凡洗净烘干或晾干备用的检验用具、器皿，均须装入铝盒或用牛皮纸包扎好，经12130分钟热压灭菌后,取出置60干燥烘干保存备用。4. 常规消毒灭菌法4.1. 将待灭菌器具置干燥箱内，逐步加热至140160保持2

33、小时后再逐步自行降至常温，方可取出，即可达到完全灭菌的目的。4.2. 湿热灭菌法高压蒸汽灭菌是采用高压灭菌器，根据灭菌物品的不同，灭菌时温度和时间也有所不同。常用的温度和时间：a. 11520分钟；b. 1212030分钟。附录三：培养基、试药及稀释剂1. 培养基1.1. 培养基制备注意事项a. 制备培养基时所用的各种玻璃器皿和分装容器、棉塞等，都必须经过妥善洗刷，洁净无污、干燥者，不得用铜、铁制容器，可用玻璃，搪瓷器皿。b. 高压灭菌时，应将灭菌锅内的冷空气全部排除后，锅内培养基达到100时方可关闭蒸汽阀，否则温度不足，则灭菌不彻底。c. 培养所需要的pH值，是以灭菌后所测的pH值为准，因此

34、，调节pH应让培养基冷却后再调，用NaOH调节的弱碱性培养基，高压灭菌前pH可比最终要求的约高0.2左右，灭菌后基本合适。d. 制成后的培养基应置冷暗处或冰箱内保存，一般培养基保存期不超过两周，特殊培养基不超过3天。1.2. 营养琼脂培养基：取营养琼脂培养基34g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116高压灭菌20分钟。(用于细菌记数)1.3. 玫瑰红钠琼脂培养基（虎红琼脂培养基）：取玫瑰红钠琼脂培养基30g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116高压灭菌20分钟。（用于霉菌及酵母菌记数）1.4. 胆盐乳糖培养基（BL）：取麦康凯琼脂培养基（MacC）、磷酸盐葡萄胨水培养基15.8

35、g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116高压灭菌20分钟。（用于大肠杆菌检查）1.5. 蛋白胨水培养基：取蛋白胨水培养基15g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116高压灭菌20分钟。（用于大肠杆菌检查）1.6. 4甲基伞形酮葡萄 酸培养基(MUG)：取4甲基伞形酮葡萄培养 g，加1000ml蒸馏水，分装，115高压灭菌20分钟。（用于大肠杆菌检查）1.7. 曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）：取营养琼脂培养基100ml加热溶化后，冷至60，按无菌操作加入灭菌的曙红钠指示液2ml、20%的乳糖溶液5ml及亚甲蓝指示液1.31.6ml，摇匀，倾注平皿即得。（用于大肠杆菌检查）。1.8. 蛋白胨水培养基：取胰蛋白胨10g、氯化钠5g、水1000ml混合，加热溶化，调节pH值使灭菌后为7.30.1，分装于小试管，灭菌即得。（用于大肠杆菌检查）。1.9. 磷酸盐葡萄糖胨水培养基：取胨7g、磷酸氢二钾3.8g、葡萄糖5g、水1000ml混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.30.1，分装于小试管，121，灭菌15分钟即得。1.10. 枸橼酸盐培养基：取氯化钠5g、枸橼酸钠（无水）2g、硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾 1.0g、磷酸二