实时荧光定量PCR检测感病蝗虫

1、实时荧光定量PCR检测感病蝗虫体内绿僵菌rDNA基因*中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(11):7175张清平1,2彭国雄1,2,3王中康1,2,3殷幼平1,2,3夏玉先1,2,3*(1 重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室重庆400030)(2 重庆大学生物工程学院基因工程研究中心重庆400030)(3 重庆大学生物工程学院重庆市杀虫真菌工程技术中心重庆400030)摘要根据绿僵菌23S rDNA的转录间隔区（ITS）和5.8S的基因序列，设计检测感病蝗虫体内绿僵菌菌体DNA分子的特异引物，通过优化感病蝗虫菌体DNA快速制备方法，建

2、立了基于荧光定量PCR的定量检测体系。该检测方法专一、灵敏，检测下限为10pg/l绿僵菌，并且能从刚侵染48h的东亚飞蝗血淋巴中，早期定量检测到在虫体血淋巴中增殖的绿僵菌的rDNA。 关键词绿僵菌蝗虫定量检测实时荧光定量 PCR收稿日期：20050418修回日期：20050901*国家“863”计划资助项目(2004AA246050)* 通讯作者，电子信箱：yuxianxia绿僵菌作为蝗虫的重要病原真菌，已广泛应用于蝗虫防治。绿僵菌生物制剂已被世界粮农组织（FAO）推荐为环保产品，在非洲和澳洲以及中国大面积推广应用于蝗虫的生物防治1,2。类似于触杀性杀虫剂，附着在虫体表面的绿僵菌孢子必须萌发、

3、形成芽管和附着胞，穿透寄主体壁侵入蝗虫体内，以菌丝段或虫菌体等形态存在于寄主的血淋巴中3。虽然昆虫病原真菌的致病机制十分复杂，但是病原真菌菌体在寄主体内快速增殖是使寄主昆虫罹病、死亡的前提，其增殖数量及速率直接影响病程及杀虫效率。病原真菌在寄主体内的生长繁殖情况能够直接反映致病进程，可成为杀虫真菌菌株及其制剂毒力评价的重要指标。传统的真菌检测方法难以快速定量检测昆虫体内复杂环境中的真菌，不能满足相关研究需要。实时定量PCR已成功地用于定量检测人体病原真菌、环境真菌、植物病原真菌等。Gachon 等（2004）利用实时定量PCR监测植物病原真菌在寄主体内的生长情况，将病原真菌在寄主体内的早期生长

4、量作为评价植物病原真菌的致病性指标。建立实时荧光PCR定量检测昆虫体内绿僵菌的体系，可以早期定量检测东亚飞蝗体内病原真菌的数量，确定病原真菌在东亚飞蝗体内的增殖速率和动态变化，对于昆虫病原真菌的致病机理研究、真菌生防制剂配方优化都具有重要意义。1材料与方法1.1材料供试菌株：绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株CQMa102，为杀蝗专一菌株,分离自重庆缙云山自然感病的黄脊竹蝗（Ceracris kiangsu），保存于重庆大学基因工程研究中心。供试蝗虫：东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis（Mey）新羽化雄成虫，由重庆大学基因工程研究中心昆虫

5、室提供。1.2试剂与仪器蜗牛酶、崩溃酶（北京鼎国生物技术发展中心），蛋白酶K（MERCK），十二烷基磺酸钠 (SDS，BioRad)，iQTM SYBR Green supermix（BioRad），巯基乙醇、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、柠檬酸钠等其它化学试剂均为国产分析纯。台式离心机（TGL16G，上海安亭科学仪器厂），高速冷冻离心机（J20XP， BECKMAN），离心机（5417R，Eppendorf），水平电泳仪（BioRad），紫外分光光度计（Du640，BECKMAN），超声波细胞粉碎仪（JY92，宁波新芝科器研究所），Icycler iQ 定量PCR仪（BioRad）。1.3方法绿

6、僵菌孢子培养及接种孢子悬浮液配制:将绿僵菌孢子从平板上刮下，无菌水洗涤后用棉子油混和，超声波分散均匀，调节孢子浓度为108个/ml，供接种用。接种方法及接种后蝗虫的饲养4: 在每只新羽化东亚飞蝗雄虫前胸背板下接种5l浓度1×108绿僵菌孢子的悬浮液,在28、80RH的条件下饲养。 绿僵菌分生孢子DNA制备：将CQMa102孢子接种到1/4 SDA液体培养基中，28摇瓶培养48h，用纱布过滤收集菌体。采用氯化苄法提取基因组DNA5。2005, 25(11)张清平 等：实时荧光定量PCR检测感病蝗虫体内绿僵菌rDNA基因中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.2

7、5 No.11 2005图1定量PCR引物对的特异性分析Fig. 1Specificity analysis of the primer pair(a): Melting curve profile; (b): Electrophoresis of PCR products 1: CQMa102; 2: L. migratoria manilensis; 3: Negative control; 4: DNA ladder健康东亚飞蝗成虫DNA制备：参见文献6。罹病东亚飞蝗体内DNA制备：取10l罹病东亚飞蝗血淋巴于1.5 ml离心管中，加入1l蛋白酶K（20g/l）和1l SDS（10），5

8、0 水浴30min，离心去上清；加入50l预处理液（0.1mol/L EDTA，0.4%巯基乙醇）30水浴30min，离心去上清；加入100l 洗涤液（0.2mol/L磷酸二氢钠，0.1mol/L柠檬酸，pH6.0）离心去上清；加入真菌细胞壁裂解液：20 g/l 蜗牛酶、20g/l崩溃酶和0.1mol/L EDTA， 30水浴30min ；用市售微滤柱离心过滤，10l无菌水溶解DNA，存于-20备用。引物设计:根据绿僵菌CQMa102菌株23S rDNA的转录间隔区（ITS）和5.8S的基因序列7，用Primer Primers软件设计绿僵菌特异引物对， CQMaPF1：5 tggcatctt

9、ctgagtggtg 3和CQMaPR1： 5cccgttgcgagtgagtta 3（上海博亚生物技术有限公司合成），预期扩增片断长度329bp。引物特异性测定：分别以1g/l绿僵菌和东亚飞蝗基因组DNA 为模板，采用Icycler iQ定量PCR仪进行定量PCR扩增。反应体系25l/管：模板1l，绿僵菌引物对终浓度0.4mol/L，iQTM SYBR Green supermix sample 12.5l，加水至25l。FQPCR反应条件：94 3 min；94 10s，60 10s，72 10s，72实时采集荧光，共40个循环；72延伸5min。测定熔解曲线的反应条件：95，0s；55，

10、10s，95，10s，每隔10s升高0.5，实时收集荧光。标准曲线建立:测定绿僵菌CQMa102菌体模板DNA的OD值，计算模板DNA浓度，按10倍系列稀释成1×101g/ml、1g/ml、1×10-1g/ml、1×10-2g/ml、1×10-3g/ml、1×10-4g/ml，以上述模板为标准品进行定量PCR扩增，以荧光信号的累计反映PCR进程。利用IcyclerTM IQ Opitical System Software Version 3.0a软件（BioRad）自动进行数据分析并绘制标准曲线。常规镜检:接种绿僵菌孢子后，每天定时采集蝗虫血

11、淋巴制片后，在数码光学显微镜(400×)下观察并采集图像。2结果与分析2.1引物特异性从图1可以看出：绿僵菌基因组DNA熔解曲线仅有一个明显的单峰，而东亚飞蝗基因组DNA未出现高峰(a)。与此结果相一致，从绿僵菌DNA可扩增出靶带，而东亚飞蝗基因组DNA中不能扩增出任何DNA谱带（b）。这表明，设计的引物对特异性强，以该引物对进行PCR能够区分CQMa102与东亚飞蝗的基因组DNA，适合于定量检测东亚飞蝗体内的绿僵菌。2.2标准曲线建立及检测灵敏度用2.1中得到的特异引物，以不同浓度绿僵菌菌体DNA为模板进行定量PCR扩增，制作标准曲线的动力曲线(图2a)和标准曲线(图2b)，由Ic

12、yclerTM IQ 自动拟合标准曲线，拟合方程为：Y=-3.645X+15.875 (Y轴为Ct值，X轴为模板DNA浓度的对数)，PCR扩增效率为88.1%，模板DNA的线性检测范围为10-410g/ml。图2CQMa102的标准曲线 （a）: 动力曲线; （b）: 标准曲线Fig. 2Quantification of serial diluted DNA of CQMa102(a): Kinetics of fluorescence signal at different concentrations of DNA; （b）: Standard curve obtained by plo

13、tting the concentration ofDNA versus the cycle number2.3最适接种时期测试因新羽化的东亚飞蝗健康雄虫的体重以0.70.8g居多，故选取该体重的健康雄虫进行试验。分别在东亚飞蝗羽化12h、24h和36h后进行接种试验。每个羽化时间下设5个平行样，接种试验重复3次。接种后定期从罹病蝗虫血淋巴中提取DNA进行定量PCR检测，检测结果Ct值通过标准曲线换算为DNA浓度（用10x表示），并用DPS数据处理系统进行统计分析。检测结果：羽化的蝗虫侵染60h后血液中绿僵菌DNA的浓度分别为：10-2.185±0.202、10-2.789±

14、;0.035和10-3.244±0.032g/ml，羽化12h和24h检测结果差异显著（P0.05），羽化12h和羽化36h检测结果差异极显著（P0.01）。这表明，东亚飞蝗羽化后随着时间的推移，虫体体壁加厚，外骨骼硬化，病原菌侵入机率减小。蝗虫羽化初期因体壁柔软，绿僵菌更易入侵，新羽化蝗虫个体差异很大，导致真菌的侵染速率差异增大，不利于其体内真菌的定量检测；羽化36h的东亚飞蝗个体差异较小，但绿僵菌入侵较难。综合考虑绿僵菌的侵染速度与检测稳定性因素，选择羽化24h的东亚飞蝗进行试验。2.4罹病东亚飞蝗血淋巴中绿僵菌菌体数量的动态变化用绿僵菌接种东亚飞蝗后，在不同时间从罹病蝗虫血淋巴

15、中提取增殖绿僵菌菌体的DNA进行FQPCR测试，同时在数码显微镜下观察。将循环阈值Ct值通过标准曲线换算为DNA 浓度（用10x表示），并用DPS数据处理系统进行统计学分析。FQPCR测试结果（表1）：在接种60h之前，随着时间的延长，东亚飞蝗体内绿僵菌DNA浓度逐渐增加；接种60h后，绿僵菌DNA浓度迅速上升,到72h时绿僵菌DNA浓度比60h时增加近1 000倍（3个数量级）。 表1蝗虫血淋巴中绿僵菌DNA浓度变化Table 1Changes in DNA concentration ofM. anisopliae in the haemolymph of mycosedlocust at

16、 different time after inoculation侵染时间(h)DNA 浓度(10x g/ml)24-36-4.254±0.03248-3.683±0.03560-2.745±0.033721.732±0.034数码显微镜下观察结果(图3), 接种后48h取蝗虫血淋巴制样检查未能发现增殖的绿僵菌，接种60h后可以找到少许绿僵菌菌丝段，而在接种72h以后，才可以从蝗虫血淋巴中观察到大量的绿僵菌菌丝段。 图3接种后绿僵菌菌体在罹病东亚飞蝗血淋巴内的形态Fig. 3The morphology of hypha, hyphabody and m

17、ycelia of M. anisopliae against Locusta migratoria manilensis male adult after inoculation with M. anisopliae oil miscible formula1: Haemocyte; 2: Metarhizium anisopliae var. acridum strain CQMa1023讨论如何从东亚飞蝗体内稳定地获得适合于PCR扩增的DNA模板，是建立昆虫血淋巴中昆虫病原真菌定量检测体系的关键技术。真菌细胞壁主要由几丁质和1，3葡聚糖等组成，经用蜗牛酶、崩溃酶等制备真菌原生质体的破壁酶

18、单一或混和处理有助于绿僵菌胞壁的消解，复合酶的破壁效果优于单一酶类8；而对大分子具有解聚作用的DTT、巯基乙醇等硫醇试剂，能够使真菌细胞壁中的某些组分发生改变或破坏，有利于酶分子的进入，从而促进真菌细胞壁的降解。本文采用基于混和酶的胞壁裂解液，可使绿僵菌孢子在2h内完全崩解，并通过微滤柱去除血液中的PCR反应抑制物质，得到适用于PCR扩增的绿僵菌DNA模板。该方法无需酚氯仿抽提，简便、快速、样品稳定，也适合从微量样品中制备其它真菌DNA模板。罹病昆虫体内的增殖真菌菌体包括液生孢子、菌丝段或虫菌体3，传统上用显微镜法观察计数，这种方法因真菌侵入昆虫血腔后的菌体形态的多样性，芽生孢子、菌丝段或虫菌

19、体等3，不便区别，难以正确计数, 导致显微镜观察计数的实验误差偏大。另外，显微镜观察计数要求血球计数器的计数室每小格内有510个菌体以上，才有统计学意义9，即绿僵菌菌体浓度应在104个/l，而侵染初期蝗虫血淋巴中含绿僵菌菌体数量(20l/只成虫)远低于此值，尽管在侵染后期罹病虫体干缩变硬成为僵虫时，体内菌体数量会大大增殖，但此时已不能从虫体采血计数，所以常规的镜检计数方法不能满足对昆虫体内的真菌菌体早期检测的需要。本文利用基于绿僵菌rDNA基因片段设计的PCR引物对、优化的DNA制备方法以及荧光定量PCR技术早期检测昆虫体内的病原真菌DNA，操作简便、快速、灵敏、准确，绿僵菌CQMa102接种

20、后36h即可检出，而显微镜观察计数法要在接种72h才容易观察。因此，荧光定量PCR方法不但缩短检出时间，而且结果客观、准确，可以早期检测东亚飞蝗体内增殖绿僵菌的不同形态菌体的数量，以确定病原真菌在东亚飞蝗体内的增殖速率和动态变化。可以满足绿僵菌毒力菌株选育、不同制剂配方、质量评价以及监控过程中对杀虫毒力评价的需要，另外对昆虫病原真菌入侵后的杀虫机理、毒力因子鉴定等基础研究都具有重要意义。参考文献1 Hunter D M, Milner R J, Spurgin P A. Aerial treatment of the Australian plague locust Chortoicetes

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25、 9092Shen P, Fan X R, Li G W. Experimental Technology of Microbiology. 3rd ed. Beijing:High Education Publishing Company, 1999. 9092Detection of Metarhizium anisopliae rDNA in Haemalymph of Infected Adult Locust by Realtime Fluorescence Quantitative PCR ZHANG Qingping1,2PENG Guoxiong1,2,3WANG Zhongkang1,2,3YIN Youping1,2,3XIA Yuxian1,2,3(1 Genetic Engineering Research Center, Chongqing UniversityChongqing400030, China)(2 Key Laboratory of Biomechanics & Tissue Engineering, Ministry of Education, Chongqing UniversityChongqing400030, China)(3 Chongqing Engineering Research Center for F