治疗药物监测HPLC分析方法建立探讨

1、治疗药物监测HPLC分析方法建立探讨 监测药物种类繁多：茶碱、华法令、氯丙嗪、抗癫痫类药物、镇静催眠类药物、胺碘酮、免疫抑制药物等等。 可监测浓度范围：紫外可见光监测器，荧光检测器（高各数量级），电化学检测器（10-12g），质谱检测器（10g)，但具体与药物本身结构与检测条件有关 主要的缺陷：操作复杂、容易被干扰、 了解所要监测药物的基本情况：监测范围、理化性质、监测意义 查阅文献 结合实际条件。 、为什么要考察标准曲线？ 、为什么要考察紧密度？ 3、为什么要考察方法回收率？ 、为什么要考察绝对回收率？ 、用已知的东西去了解未知东西。 、合理的东西是多大概率上的合理 标准曲线是定量分析的根本

2、依据 、药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号（通常采用峰面积A）成比例(正比) 即CCAA或MM AA 图示：通常外标法计算CX： CXCAX/A结论：所建立的方法充分条件就是测定范围内标准趋向成线性关系NCCLS EP6-P，定量分析方法线性的评价：推荐指南（1986）。本文件包含评价仪器或定量分析方法是否满足制造商线性要求的方法; 以及为厂商提供了检测线性范围声明的指南。本文件为设计评估临床化学仪器精密性能试验提供了指南；将结果估计的精密度与制造商的精密要求进行比较，以及确定比较是否有效。 、相关系数是评价线性的客观标准，但应考虑到实际测定的需要，合理采用权重系数（x,1/x2,

3、1/y,1/y2)（回收率）、标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度。 、研究方法线性一般采用6-10点，并非点越多越好，合理是统计学上的合理。、影响标准曲线的可能因素 仪器相应因素（仪器响应线性与方法线性的关系） 样品方法因素 色谱条件EP5-A，临床化学设备精密性能的评价：批准指南（1999）。本文件为设计评估临床化学仪器精密性能试验提供了指南；将结果估计的精密度与制造商的精密要求进行比较，以及确定比较是否有效。、精密度表示平行测定结果的互相接近程度,一般用变异系数(coefficientofvariation,cv) 表示。亦即重复测定同一实际样品或模拟生物样品的相对标准偏差()

4、。、可分为日内（withinday)CV和日间(daytoday),批内(intraasay)和批间(interassay)。批内、批间更具有实际意义. 一般要求应小于15%,低浓度水平或复杂方法可放宽到小于20%。 精密度仅表示测定的重现性,但精密是保证准确的提前。 精密度考察设计：点，样品平行 RCC1 RCC C：通过标准曲线计算所得浓度 C：实际加入标准品浓度 R：回收率 定量临床检验方法的初步评价：批准指南（1998）。 本指南讨论分析方法或仪器性能初步评价的实验设计和数据分析（参见相产出版物GP10-A） 定义：回收率是用来衡量测定方法对生物样品中待测物的检测效能的,表示测定结果与

5、真实值的接近程度,亦即测量值的正确性。 高、中、低浓度回收率可能不同。相对回收率能直接反映测定结果与真实值的接近程度,应控制在100%左右(95%105%)。 模拟生物样品经整个样品处理过程,而相应标准溶液直接分析,两者的响应值之比称为绝对回收率(); RAA2 绝对回收率与相对回收率关系 绝对回收率与相对精密度的关系 绝对回收率要求,所得响应值之比称为相对回收率relativerecovery)。绝对回收率一般应大于70%,过低说明方法中待测物质损失严重,过高(105%) ,检测限(limitofdetection,LOD)是指分析方法定性检测生物样品中待测物的最低浓度。/)3 定量限(Li

6、mtofquantification,LOQ) 是指分析方法能准确精密定量测定生物样品中待测物的最低浓度。/10 EP7-P，临床化学干扰试验，推荐指南（1986）。 本指南提供了描述干扰物质对试验结果影响的信息及程序。 室内质控质量控制质量控制(Quality Control, QC) 为达到质量要求所采取的作业技术和活动。 质量控制包括作业技术和活动，其目的在于监视过程，并排除质量环节中所有阶段中导致不满意的原因，以取得经济效益。 质量控制和质量保证的某些活动是相互联系的。 室间质评室间质量评价（室间质量评价（External Quality Assessment, EQA） 由非本单位的

7、机构，采用一系列办法来客观地评价实验室的结果，其主要目的是建立实验室间的可比性。该计划是多个标本周期性地发送到实验室进行分析和/或鉴定，将每一实验室的结果与同组的其它实验室的结果或靶值进行比较，并将比较的结果报告给参与的实验室。 用已知证明未知 合理是统计上的合理 标准曲线是根本 精密度结果是标准曲线的保障 相对回收率是分析方法的效能指标 绝对回收率是重要相关因素 灵敏度、检测限、选择性是性能参数 临床要求 快速 样品量少 ，一般毫升 样品复杂，不确定干扰较多 测定准确度要求高 5.2.1 样品制备样品制备目的是使样品与所使用的HPLC方法相兼容，即把分析样品中的待测组分转化为适合HPLC直接

8、进样分析的试液。对于一些较复杂的样品，样品制备还包括预分离富集、衍生化等预处理步骤。液相色谱法的精密度和准确度往往取决于样品制备的质量。 一、样品的溶解一、样品的溶解用于溶解分析样品的溶剂应与液相色谱流动相互溶，最好选用流动相来溶解或提取被分析样品的待测组分，这样可以避免溶剂峰的干扰。制备好的分析试液应为均相溶液，无不溶物，否则在进行色谱分析之前应进行0.45m或0.2m微孔膜过滤。 一过滤和离心一过滤和离心 对于基体复杂的样品液，不溶物可以通过对于基体复杂的样品液，不溶物可以通过过滤或高速离心除去。有时加入合适沉淀过滤或高速离心除去。有时加入合适沉淀剂或改变溶剂，使大分子基质以沉淀方式剂或改

9、变溶剂，使大分子基质以沉淀方式除去。除去。 水样中的许多待测有机化合物可以通过液液萃取到有机相后进行液相色谱分析。 利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱分离原理，使液体样品通过一吸附剂小柱，保留其中某些组分，再选用适当的溶剂冲洗杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。一、配制一、配制对于二元溶剂或多元溶剂等度洗脱，液相色谱流动相通常均按溶剂体积比配制。要求溶剂必须互溶。二、过滤二、过滤HPLC流动相使用前要用0.45 m微孔膜过滤。三、脱气三、脱气（1） 溶于流动相的空气会影响液相色谱系统的操作性能。如气泡进入泵腔将使高压泵流速不稳；而流动相通过柱子时其中的气泡受到压力

10、而压缩，流出柱子到检测器时，会因为压力降至常压而将气泡释放出来，造成检测器噪声增大，基线不稳。流动流动相配相配制制过滤过滤脱气接抽气机微孔膜泵泵 HPLCUV测定甲氨喋呤血药浓度 血药浓度监测能有效反映MTX在体内的浓度变化过程，从而为临床治疗与解救提供参考 大剂量MTX化疗是儿童急性淋巴细胞白血病（ ALL ）联合化疗方案的重要组成部分 国内有关HPLC测定MTX的方法1-4进行试验时，发现样品用蛋白沉淀法，低浓度时MTX受杂峰干扰严重，且难以达到临床所需最低定量浓度，而固相萃取方法则难以满足宽浓度线性范围的要求，且分析成本高、周期长。 1 GE Yong-qian（葛勇前），LU Guo-

11、chun（陆国椿）。Quantitation of Plasma Methotrexate Content by HPLC（HPLC法测定人血浆中甲氨喋呤的浓度）.Chin J Pharm Anal（药物分析杂志），2001，21（6）418 420（in Chinese） 2 Zhang Huanian（张华年），Wen Lingli（文玲莉），Zhang Shaowen（张少文），et al.HPLC Assay forMethotrexate Utilizing Solid Phase Extraction Purification and Separation of Biologica

12、l Sample（固相萃取高效液相色谱法检测生物样本中甲氨喋呤）. Chin J Pharm Anal（药物分析杂志），2000，20（6）：401 40（in Chinese）3 Wu Chuang（吴闯）， Yang Zhenhong（杨正鸿），Lin Guiyiun（林贵远），et al.Determination of methotrexate level in plasma and cereberospinal flui by HPLC（反相高效液相色谱法测定血浆和脑脊液中甲氨喋呤浓度），（中国医院药学杂志），1999，19（5）：272-274（in Chinese）4 Zhang

13、 Bi-kui(张毕奎)，LI Huan-de(李焕德)，ZHANG Xiang-sheng(张湘生),et al.Studies on serum drug monitoring and elimination of high-dose MTX chemotherapy in patients with bone and soft tissue malignant tumors(骨及组织肿瘤大剂量甲氨喋呤化疗时血药浓度的动态监测及体内消除研究).Chin Pharm J,(中国药学杂志) 2002.4.; 37(4): 290-293 色谱柱为Zirchrom Kromasil C18柱（ 250 4.6 mm，5 m ），柱温40 ，流动相为乙腈：25 mmol.L-1磷酸水溶液（17 : 83 v / v），流速1.0 mL.min-1,检测波长为306 nm 。 取血浆0.2 mL置于1.5 mL尖底塑料离心管中，准确加入乙腈0.6 mL，旋涡振荡1 min，高速离心5 min（9500 r / min），