细胞成像技术小组展示第10组

1、超分辨荧光显微镜技术超分辨荧光显微镜技术报告小组：第10组小组成员：贾棋 江超 刘明 肖雪 邢洁衍射极限衍射极限2超分辨荧光显微镜技术衍射极限是指一个发光点经光学系统成像，由于衍射的限制，不可能得到理想像点，而是得到一个夫朗和费衍射像。根据瑞丽判据，最小分辨率由艾里斑半径决定。r=0.61/NA 由于数值孔径有限，分辨率最小为波长的一半！SIM是常规荧光显微镜在匀场照明的基础上，通过改变照明是常规荧光显微镜在匀场照明的基础上，通过改变照明光的空间结构，使记录的图像包含更多高频信息，利用特光的空间结构，使记录的图像包含更多高频信息，利用特定的算法将这些信息分离出来，重构出超分辨图像。定的算法将这

2、些信息分离出来，重构出超分辨图像。结构光照明显微镜结构光照明显微镜(SIM)3超分辨荧光显微镜技术结构光照明特点结构光照明特点4超分辨荧光显微镜技术其成像速度显著优于普通的点扫描显微镜，达到0.09秒/帧，而其空间分辨率也达到了100 nmSTED基本原理：STED的关键是减小了单个扫描点出的有效荧光发光面积，突破了衍射极限的限制。利用了当荧光分子被损耗激光照射时，可以强行猝灭回到基态的特性。受激发射损耗显微技术受激发射损耗显微技术（STED）5超分辨荧光显微镜技术6超分辨荧光显微镜技术STED采用两束照明光，一束为激发光，另一束损耗光。当激发光的照射使衍射斑范围内的荧光分子被激发使得电子跃迁

3、，而损耗光使部分处于激发光斑外围的电子以受激发射的方式回到基态，位于光斑中心的被激发电子不受损耗光的影响，以自发荧光的方式回到基态。这样有效荧光的发光面积的以减小，从而提高了分辨率。要在 STED 显微术中实现较高的空间分辨率，需要在样品上施加光强较强的损耗光。然而，较强的损耗光强不仅会增大功耗，同时也会对荧光样品造成光漂白和光毒害。受激发射损耗特点受激发射损耗特点7超分辨荧光显微镜技术一般来说，STED 显微术可实现的分辨率可由以下公式表示:荧光分子首先被特定激光照射到暗状态；然后打开激活激光，激发出稀疏单分子；记录好单分子后，利用漂白激光将其漂白接着打幵激活激光重新激发出新的单分子。如此反

4、复，得到大量的稀疏存在图像，然利用高斯函数去拟合这些中心，这样就获得了突破衍射极限的超分辨图像。8超分辨荧光显微镜技术光敏定位显微光敏定位显微镜镜（PALM）1.极高的分辨率，横向分辨率可以到达10 nm !2.可以进行单分子轨迹追踪和单分子定量计算中。3.对荧光蛋白有要求。光敏定位显微特点光敏定位显微特点超分辨荧光显微镜技术10超分辨荧光显微镜技术 随机光学重建显微随机光学重建显微镜镜（STORM）11不同的波长可以控制化学荧光分子Cy5 在荧光激发态和暗态之间切换，例如红色561 nm 的激光可以激活Cy5 发射荧光，同时长时间照射可以将Cy5 分子转换成暗态不发光之后，用绿色的488 n

5、m 激光照射Cy5 分子时，可以将其从暗态转换成荧光态，而此过程的长短依赖于第二个荧光分子Cy3 与Cy5 之间的距离因此，当Cy3 和Cy5 交联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性将Cy3 和Cy5 分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到最后的内源蛋白的高分辨率影像随机光学重建显微技术染料随机光学重建显微技术染料超分辨荧光显微镜技术近场光学显微镜，用孔径远小于光波长的探针代替光学镜头。当把这样的亚波长探针放置近场区域时，通过探测束缚

6、在物体表面的非辐射场，可以探测到丰富的亚微米光学信息。近场扫描光学显微镜镜(NSOM)12超分辨荧光显微镜技术近场扫描光学显微镜物理原理近场扫描光学显微镜物理原理13超分辨荧光显微镜技术利用平面波角谱：)1/2exp()0 ,/,/(),/,/(220ZAZA这是一个倏逝波，分析知U(x,y,Z)振幅随Z指数衰减，倏逝波体现物体的空体现物体的空间精细表面结构间精细表面结构，空间频率越高，即物体越精细。ddyxiZiAZyxU)(/2exp1/2exp0 ,/,/1),(2202）（技术比较14超分辨荧光显微镜技术显微镜显微镜优点优点缺点缺点SIM设备简单，成像时间快。无侵入性，无损伤。分辨率不如其他显微镜高。STED分辨率高，成像时间快，可以实时观察和细胞内运动。由于消耗光增大功耗，同时也会对荧光样品造成光漂白和光毒害。设备复杂。PALM分辨率极高，一对一的标记可以进行单分子轨迹追踪和单分子定量计算。成像时