生物化学实验电子教案.02.22

1、精选文档生物化学试验电子教案欢迎同学们学习生物化学试验 第一部分 生物化学试验基本要求及技术一、生物化学试验室规章1. 每个同学都应当自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。2. 试验前必需认真预习，生疏本次试验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开头试验。试验过程中要听从老师的指导，严峻认真地按操作规程进行试验，并把试验结果和数据准时、照实记录在试验记录本上，文字简练、精确，要求同学们记录完整精确的试验数据，养成良好的实事求是的工作作风和求真务实的科学态度，严禁伪造试验数据，弄虚作假。完成试验后经教员检查同意，方可离开试验室，课

2、后写出试验报告，于下次试验前上交。3. 试验台面应随时保持洁净，仪器、药品摆放整齐，公用试剂用毕，应马上盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在试验台面和地上。试验完毕，仪器须洗净放好，将试验台面抹试洁净，才能离开试验室。4. 使用仪器、药品、试剂和各种物品必需留意节省。洗涤和使用仪器时，应当心细致，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发觉故障须马上报告教员，不得擅自动手检修。5. 试验室内严禁吸烟！煤气灯应随用随关，严格做到：人在火在，人走火灭。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。试验完毕，应马上关好煤气开关和水笼头，拉下电闸。离开试验室以前应认真、负责地

3、进行检查，严防发生平安事故。6. 全部试验用的废液，废弃物等，都要收集在适当的容器内，加以储存再处理，不能倒在水槽内或处处乱扔。7. 仪器损坏时，应照实向教员报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。8. 试验室内一切物品，未经本室负责教员批准，严禁携出室外，借物必需办理登记手续。9. 每次试验课由班长负责支配值日生。值日生的职责是负责当天试验室的卫生、平安和一切服务性的工作及填写试验状况登记卡和试验记录。二、试验报告要求及格式试验结束后，应准时整理和总结试验结果，写出试验报告。试验报告用统一的试验报告纸写，在第一行写明姓名，学号，组别及班级。依据试验内容可分为定性和定量试验两大类，下面简洁介绍试

4、验报告的格式。（试验名称） 姓名 学号 日期目的和要求原理试剂配制及仪器操作方法试验结果争辩与分析通常每次试验课只做一个定量试验，在试验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简洁扼要的叙述，但是对于试验条件（试剂配制及仪器）和操作的关键环节必需写清楚。对于试验结果部分，应依据试验课的要求将肯定试验条件下获得的试验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始试验数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较试验组与对比组试验结果的图表等。另外，还应针对试验结果进行必要的说明和分析。争辩部分可以包括：关于试验方法（或操作技术）和有关试验的一些问题，照试验的正常结果和特别现象以及思

5、考题，进行探讨；对于试验设计的生疏、体会和建议；对试验课的改进意见等。三、生物化学技术的争辩手段、方法、内容Ø 手段：包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、各种层析设备、各种电泳装置、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、摇床等等。Ø 方法：透析技术、电泳技术、层析技术、 离心技术、分光光度计技术、免疫化学技术Ø 内容：糖类、脂类、核酸、蛋白质的分子结构、提取、分别、纯化及其定性、定量鉴定、分析争辩。Ø 手段：包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、各种层析设备、各种电泳装置、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、摇床等等。Ø 方法：透析技术、电泳技术、

6、层析技术、 离心技术、分光光度计技术、免疫化学技术Ø 内容：糖类、脂类、核酸、蛋白质的分子结构、提取、分别、纯化及其定性、定量鉴定、分析争辩。（一 ）紫外-可见分光光度分析法基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法。 分为:光谱分析法和非光谱分析法。 光谱分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的放射光、吸取光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。 （二） 层析法 （chromatography）层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子外形及大小、分子亲和力、安排系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一

7、相流过固定相，称为流淌相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分别的目的。 固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分别的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流淌相：在层析过程中，推动固定相上待分别的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流淌相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分别。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流淌相开放，以达到分别鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸

8、附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分别和鉴定。 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分别制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分别。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常接受柱层析形式。（三） 电泳技术 电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 电泳现象早在十九世纪初就已发觉（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳试验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特殊是近几十年以来，电泳技术进展很快，各种类

9、型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。电泳的分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置简单，价格昂贵，费时费劲，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分别物质在支持介质上分别成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和集中，以使被分别的成分得到最大辨别率的分别。区带电泳由于接受的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎

10、盘球蛋白，其优点是简便快速，便于保存照相，比纸电泳辨别率高。 v 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分别物的电荷多少进行分别。淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。自然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，辨别率低，试验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分别分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分别、纯化及检测。其辨别率较高。a.聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前试验室最常

11、用的支持介质 b.另外依据支持介质外形不同，区带电泳可分为：薄层电泳、 板电泳、柱电泳。c. 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。（四） 生物大分子的制备 在自然科学，尤其是生命科学高度进展的今日，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的争辩是探求生命奇特的中心课题，而生物大分子结构与功能的争辩，必需首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的争辩就无从谈起。然而生物大分子的分别纯化与制备是一件格外细致而困难的工作。与化学产品的分别制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：生物材料的组成极其简单，经常包含有数百种乃至几千种化

12、合物。很多生物大分子在生物材料中的含量极微，分别纯化的步骤繁多，流程长。很多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分别过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难精确估量和推断。 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发觉新的物质。建立相应的牢靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。通过文献调研和预备性试验，把握生物大分子目的产物的物理化学性质。生物材料的裂开和预处理。分别纯化方案的选择和探究，这是最困难

13、的过程。生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。产物的浓缩，干燥和保存。其次部分 试验室操作试验 试验二 粗脂肪的提取和定量测定索氏提取法一、目的和要求1. 学习和把握粗脂肪的定量测定法索氏提取法。 2. 学习和把握用重量分析法对粗脂肪进行定量测定。3 将理论能用于实践当中:比较不同材料中所含粗脂肪的含量。二、原理脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物, 能溶于脂溶性有机溶剂。本试验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通

14、常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30ºC -60 ºC的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。四、仪器设备及试剂1、脱脂棉 2、镊子 3、分析天平 4、电热恒温水浴锅 5、恒温烘箱 6、索氏脂肪提取器 7、索氏脂肪提取仪 8、滤纸 9、干燥器 10 无水乙醚五、步骤1.抽提瓶在105±2烘箱中烘至恒重，材料干燥至恒重。2.称取干燥后的材料1-2g,放入研钵中研磨(越细越好)将研磨好的材料用脱脂滤纸包住,用少许脱脂棉擦拭研钵壁上粘的材料及油脂,也一并放入滤纸包. 用棉线拴住滤纸包,将滤纸包放入抽提

15、管，在抽提瓶中加入2/3体积的无水乙醚在70-75的水浴上加热，使乙醚回流，把握乙醚回流次数为每小时约10次，共回流约50次，或检查抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。3 取出试样，仍用原提取器回收乙醚直至抽提瓶全部吸完，擦净瓶外壁，将抽提瓶放入105±2烘箱中烘干至恒重。 六.计算W1W0粗脂肪%= ×100W式中：W样品重（g）W0提取瓶重（g）W1提取瓶和脂肪重（g）七、留意事项1向滤纸筒内填装样品及回流提取过程中都不应外漏，否则重做。2应用无水乙醚，并在通风柜中进行蒸干，试验室内禁止明火与吸烟。3提取瓶中加入的乙醚不能少于1/2,也不能多余2/3。试验三、蛋

16、白质的含量测定目前常用的有四种古老的经典方法:凯式定氮法，,双缩脲法( Biuret法) ， Folin -酚试剂法( Lowry 法)和紫外吸取法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法( Bradford法).其中Bradford 法和 Lowry 法灵敏度高，比紫外吸取法高10-20倍,比 Biuret 法高100倍以上.凯氏定氮法比较简单,但较精确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质 1、 凯氏定氮法一 试验目的和要求(1)把握利用凯式定氮法测定生物材料中氮的含量和蛋白质的含量的方法(2)理论用于实践中:比较不同的材料中蛋白质的含量二 原理 样品与浓硫

17、酸共热,含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,依据此酸液 被中和的程度可计算得样品氮的含量.以甘氨酸为例:1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4 反应式为： H2SO4=SO2+H2O+O R. CH.COOH+O=R.CO.COOH+NH3 NH3 R.CO.COOH+O=nCO2+mH2O 2NH3+H2SO4=(NH4)2SO42.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。 反应式为: 2NH4+OH-=NH3+H2O NH3+H3BO3=NH4+H2

18、BO3-3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，依据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。三 试验试剂HCI标准溶液（0.01 mol.L-1 ） H3BO3溶液(2%)H2SO4(浓)NaOH溶液(30%)K2SO4(固体)CuSO4.5H2O(固体)甲基红溴甲酚绿混合指示剂四 试验仪器:凯氏烧瓶（100ml）:1个 50ml容量瓶凯氏定氮装置 烘箱移液管(10ml): 1支 酸式滴定管(10ml): 1支 分析天平 电炉 五 试验步骤一、 消化液的制取精确称取干燥样品0.5g，置于凯氏烧瓶内，加入0.2g(K2SO4,CuSO4.5H2O)混合物及15ml

19、浓H2SO4，加数粒玻璃珠，缓慢加热，当硫酸分解开头放出二氧化硫白烟后，即加大火力至溶液澄清，再连续加热约1h，冷却至室温。沿瓶壁加入50ml纯水，溶解盐类，冷却，转入100ml容量瓶中，以纯水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀。二、NH3的固定1、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中加数滴甲基红指示剂、几滴H2SO4及数粒沸石 在整个蒸馏过程中需保持此液为橙红色，否则补加H2SO4。接收液为20ml 2%的H3BO4溶液，其中加2滴混合指示剂，接收时使装置的冷凝管下口浸入吸取液的液面之下先用蒸汽洗涤整个装置,约15分钟,用含指示剂的硼酸溶液检测装置是否洗洁净。假如不变色才

20、说明洗净了. 2、蒸馏:移取10.0ml样品消化液，经进样口注入反应室内，用少量水冲洗进样口，然后加入10ml 30% NaOH溶液于反应室内，塞好玻璃塞，防止氨的逸出。从开头回流记时，自变色起再蒸馏4min，移动冷凝管下口使其离开接收液面。再蒸馏，用纯水洗冷凝管下口，洗液流入吸取液内。 三、NH3的标定用0.01mol.L-1HCl标准溶液滴定至暗红色为终点。 四）计算若测定的样品含氮量部分只是蛋白性，（如血清）则：样品的总蛋白含量（克蛋白%）=式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按试验中使

21、用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。若样品中除有蛋白外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要更简单一些。首先需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后的样品的上清液中的含氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质的含量。蛋白氮=总氮非蛋白氮蛋白质含量（克/%）=蛋白氮×6.252、 考马斯亮蓝染色法1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法,是依据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一.考马斯亮蓝G-20染料,在酸性溶液中与蛋白质

22、结合,使染料最大吸取峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合.§ 在595nm下测定的吸光度A595,与蛋白质浓度成正比.试验四、 酪蛋白的制备一、目的1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。2、把握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。二、原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。三、材料、试剂与器具（一）材料 新颖牛奶（一）试剂1、

23、95%乙醇 1 200mL2、无水乙醚 1 200mL3、0.2mol/L pH4.7醋酸醋酸钠缓冲液 300ml 先配A液与B液A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优 纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸醋酸钠缓冲液3000ml。4、乙醇乙醚混合液乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）（二）器具1、离心机 2、抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计 4、 电炉5、烧杯 6、温度计四、操作步骤（一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加热至

24、40。在搅拌下渐渐加入预热至40、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化1、用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗沉淀2次。最终用乙醚洗沉淀2次，抽干。3、将沉淀摊开在表面 上，风干；得酪蛋白纯品。（三）精确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%）式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。五、留意事项1、由于本法

25、是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调整牛奶液的等电点肯定要精确。最好用酸度计测定。2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯洁牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。六、试验报告1、依据实际操作，以流程图形式总结酪蛋的制备方法。2、合理分析试验所得率七、思考题1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？试验五、 植物基因组DNA提取及含量测定1、 DNA的提取一 目的要求1.学习植物DNA分别的原理 2.把握植物基因组DNA提取的方法及含量的测定方法 二 试验原理利用液氮对植物组织进行研磨,从而裂开

26、细胞.细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来.EDTA抑制DNA酶的活性.再用酚氯仿抽提的方法去去除蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀.得到的DNA溶解进行定量测定：利用紫外分光光度法或定磷法进行测定。教学内容1.材料的选择2.介绍细胞裂开的不同方法3.DNA的提取4.DNA定量测定三 试验材料 仪器和药品低温离心机 ,恒温水浴锅, 台式离心机 ,琼脂糖凝胶电泳系统Tris ,EDTA , NaCl, 巯基乙醇,等1. 细胞提取液: 100mmol/L Tris.HCL pH8.0 5mmol/L EDTA pH8.0 500mmol/L NaCl 1.25% S

27、DS 1mol/L 巯基乙醇 5mol/L KCl 四 试验步骤1.取4g新颖叶片,在液氮中研磨成粉末状.2.转移至50ml离心管中,加入16ml细胞提取液,充分混匀.65水浴 保温20min.3.从水浴中取出离心管,加入5ml 5mol/L KCL溶液,混匀,水浴20min.4.4000r/min离心20min.5.将上清液转移到另一50ml离心管中.6.加等体积酚/氯仿混匀,12000r/min 离心5min, 取上清.7.加等体积氯仿,混匀,12000r/min 离心5min, 取上清.8.加入0.61倍体积的异丙醇,混匀.9.离心获得沉淀,70%乙醇洗3次.风干沉淀.10.加入500u

28、l TE缓冲液,溶解DNA.11.进行定量测定.2、 DNA的定量测定：二苯胺法一、目的和要求1、学习和了解核酸的定量测定的常用方法。2、把握用二苯胺法测定DNA 的操作方法。二、原理核酸含量的测定方法包括紫外吸取法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。本试验接受针对DNA的二苯胺法测DNA的含量。在酸性溶液中，DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该物质在595nm有最大吸取，在40400ug/mL范围内其峰值与DNA含量成正比。DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成羟基酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（max=595）。在DNA浓度为20200g/ml范围内，吸光度与DN

29、A浓度成正比，可用比色法测定。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。1. 标准曲线的制作 取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。试管012345标准DNA/ml00.40.81.21.62.0蒸馏水/ml21.61.20.80.40二苯胺试剂/ml44444460恒温水浴中保温1h，冷却，在595nm波特长比色光密度值      2. 样品的测定待测样品中测得的DNA的ug数 取

30、待测样品2ml，加入二苯胺溶液4ml，摇匀，60保温1h，然后在595nm波长出测定光密度值。依据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的DNA的ug数，按下式计算待测样品的DNA的含量。X 100 DNA%待测样品液中样品的ug数3、 DNA的定量测定：紫外分光光度法原理: 利用DNA在260nm有最大的吸取峰的特性进行测定1. 制标准曲线2 测定所提取的DNA的含量试验六、 酵母RNA的提取及组份鉴定 目的要求（1）了解并把握稀碱法提取RNA的原理和方法。（2）了解核酸的组分并把握其鉴定方法。试验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中

31、苯酚法又是试验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简洁。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90提取3-4h，快速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%

32、，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。试剂和器材一、试剂0.04M NaOH溶液；95%乙醇；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银。酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。三氯化铁浓盐溶液：将2mL 10三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400mL浓HCl。苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95乙醇100mL。定磷试剂：17硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中；2

33、.5鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；10抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液；临用时将三种溶液和水按下列比例混合：17硫酸：2.5鉬酸铵：10抗坏血酸：水1：1：1：2（V/V）。二、材料干酵母粉。三、器材移液管0.2mL（×1）,2.0mL（×1）, 1mL（×4）; 量筒10 mL（×1）, 50mL（×1）; 滴管；水浴锅；离心机。操作方法一、酵母RNA提取称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/

34、分，离心15分钟后，将上清渐渐倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算： 二、RNA组份鉴定取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。1嘌呤碱：取水解液1mL 加入过量浓氨水。然后加入1mL 0.1M硝酸银溶液，观看有无嘌呤碱银化合物沉淀。2核糖：取水解液1mL，三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。留

35、意观看核糖是否变成绿色。3磷酸：取水解液1mL，加定磷试剂1mL。在水浴中加热观看溶液是否变成蓝色。思考题1为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？2如何从酵母中提取到较纯的RNA?试验七、 底物浓度对酶促反应速度的影响米氏常数的测定一、目的1了解底物浓度对酶促反应速度的影响。2学习测定米氏常数（Km）的原理和方法。二、原理早在1913年，Michaelis和Menten首先提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式。即米氏方程式：式中：v为反应初速度；V为最大反应速度；S为底物浓度；Km为米氏常数，其单位为摩尔浓度。Km值是酶的一个特征性常数，一般说来，Km可以近似地表示酶与底物的亲和力。测定Km值是

36、酶学争辩中的一个重要方法。Lineweaver-Burk作图法是用试验方法测定Km值的最常用的比较便利的方法。Lineweaver和Burk将米氏方程改写成倒数形式：本试验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，接受Lineweaver- Burk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基，因此可以用甲醛滴定法推断自由氨基增加的数量来追踪反应。三、器材150 mL及150 mL锥形瓶225 mL碱滴定管、滴定台、蝴蝶夹310 mL及5 mL吸管4100 mL量筒5恒温水浴四、试剂和材料140 gL酪蛋白溶液（

37、pH8.5） 10 000 mL 40 g酪蛋白溶解在大约900 mL水中，再加20 mL1molL NaOH，连续振荡此悬浮液，微热直至溶解，最终用1molLHCl或1molL NaOH调到pH8.5，并用水稀释至1L。2胰蛋白酶溶液（40 gL） 2000 mL可用由胰脏制备的粗胰蛋白酶制剂配制，并放入冰箱内保存。五、操作分别向6个小锥形瓶中加入5 mL甲醛溶液和1滴酚酞，并滴加0.1molL标准氢氧化钠溶液，直至混合物呈微粉红色。全部锥形瓶中的颜色应当全都。取100mL酪蛋白溶液，加入另一锥形瓶中，在 37水 浴中保温10分钟。将胰蛋白酶液也在37水浴中保温10 分钟。然后精确地量取10

38、 mL酶液加到酪蛋白溶液中（同时 记时）。充分混合后，随即取出 10 mL反应混合物（作为零时 的样品）吹至一含甲醛的锥形瓶中。向所取的反应混合物中 加入酚酞（每mL混合物加入1滴酚酞），用0.1molLNaOH滴定直至呈微弱但持续的粉红色，在接近到达终点之前，再加入指示剂（每mL氢氧化钠溶液加入1滴酚酞）。然后，连续滴至终点，登记所用0.1molL氢氧化钠溶液的mL数。在2、4、6、8和10分钟时，分别取出10mL消化样品，精确地照上法操作。在每个样品中滴定终点的颜色应当是全都的。用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。配制不同浓度的酪蛋白溶液（7.5、10、15、20、30 gL）测定不同底

39、物浓度时的活力。思考题1如何正确测定酶促反应速度？2用试验所得的反应速度数据，对相应的底物浓度作图。由所得 曲线可以看出底物浓度对酶反应的影响有何特殊规律？试验八、胰凝乳蛋白酶的提取制备及活力测定一 试验目的和要求1.学习和把握胰凝乳蛋白酶的提取原理和方法2学习对粗提的胰凝乳蛋白酶进行初步纯化的方法和活力测定的方法二 试验原理(1) 胰凝乳蛋白酶是以无活力的酶原存在于动物的胰脏中,酶原可以被肠激酶 钙离子活化或自我活化成为有活力的酶.,制备结晶的胰蛋白酶的基本方法是用硫酸铵分级盐析的方法,比活力是指单位重量的蛋白质样品中所含酶活力的单位数。本试验从猪胰脏中提取、分别、纯化胰凝乳蛋白酶。接受酶活

40、力单位数/mg蛋白质样品表示酶的比活力。用福林酚试剂法测定样品中的蛋白质含量。把在PH7.4，温度25摄氏度时，保温10分钟能使底物酪蛋白水解出104mmol酪氨酸的胰凝乳蛋白酶规定为1个单位。酪氨酸与酚试剂作用产生蓝色，其深浅与酪氨酸量成正比，故用胰凝乳蛋白酶催化酪蛋白水解所得产物酪氨酸的多少来判定样品中胰凝乳蛋白酶的活力单位数。三 试验器材和药品高速组织搅碎机, 组织匀浆机 离心机 分光光度计 水浴锅 透析袋 大烧杯 抽滤泵 抽滤瓶 硫酸 乙酸 硫酸铵 胰蛋白酶 酪蛋白溶液 磷酸盐缓冲液 碱性铜溶液 酚试剂四 试验方法1. 猪胰凝乳蛋白酶的提纯（1）取新颖猪胰脏，放在盛有冰冷0.125mo

41、l/L硫酸的溶液中，保存在冰箱中备用。剥去脂肪和结缔组织后称重。剪碎后装入组织捣碎机内，悬浮于2倍体积的冰冷0.5mol/L硫酸溶液中，方在冰箱中过夜。将上述混悬液离心10分钟，上层液经过2层纱布过滤至烧杯中，将沉淀再混悬于等体积0.125mol/L硫酸溶液中，再离心，将2次上层液合并，即为提取液。留样测定蛋白质和酶活力。（2）分别 使用不同饱和度的硫酸铵溶液分别盐析分别蛋白质，用透析法出去盐离子。 （3）结晶 取分别所得的胰凝乳蛋白酶溶于3倍体积水中，取0.5ml留样测定蛋白质和酶活力。然后加硫酸氨（1.14g/10ml0至胰凝乳蛋白酶溶液达0.25饱和度，用0.1mol/L氢氧化钠调整pH

42、至6.0，在室温（25摄氏度）放置12小时即可消灭结晶。2、胰凝乳蛋白酶比活力的测定（1）样品蛋白质含量的测定A蛋白质标准曲线的制备 精确取肯定量的人血清活牛血清清蛋白，用凯式定氮法测定蛋白质含量。另精确取10mg的血清蛋白，用蒸馏水溶解，定容到10ml。再连续按下法配制蛋白质稀释液。 提取液10ml 加固体硫酸氨1.14g，达0.2饱和度， 放置10分钟，离心（3000r/min）10分钟 弃去沉淀 保留上层液 取7ml，加固体硫酸氨1.323g，达0.5饱和度， 放置10分钟，离心（3000r/min）10分钟 弃去上层液 保留沉淀 溶解于3倍体积的水中，装入半透膜透析袋，对pH5.0，0

43、.01mol/L醋酸缓冲液透析 两天（用1氯化钡检查已无白色沉淀产生）,离心5分钟（3000r/min）10分钟 。 弃去沉淀 保留清夜 （变性的酶蛋白） 加固体硫酸氨3.9g/10ml)，达 0.6饱和度，放置10分钟，离心10 分钟（3000r/min）10分钟 。 弃去清夜 保留沉淀（即为胰凝乳蛋白酶） 蛋白质原液（ml）蒸馏水（ml）（1）0.49.6(2)0.59.5（3）0.69.4（4）0.89.2（5）1.09.0取6支试管，编号，按下表操作。编号123456标准样品（ml）(1液2.0(2)液2.0(3)液2.0(4)液2.0(5)液2.0(6)液2.0蒸馏水（ml）2.0碱

44、性铜溶液（ml）2.02.02.02.02.02.0混匀后于室温中放置20分钟酚试剂（ml）0.20.20.20.20.20.2混匀各管，30分钟后，以第6管为空白管（光茎0.5cm），在A680nm处读取吸光值。按凯式定氮法测定的蛋白质含量，算出各管的蛋白质浓度，以此为横坐标，各管的光吸取值为纵坐标作图，得标准曲线。（2）测定样品蛋白质含量 将胰凝乳蛋白酶提取液A、0.6饱和度硫酸氨制得的胰凝乳蛋白酶B、胰凝乳蛋白酶溶液C，分别用pH7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释适当倍数。取4支试管，编号，按下表操作。管号ABC对比样品（ml）2.02.02.02.0蒸馏水（ml）碱性铜溶液（ml

45、）2.02.02.02.0混匀后于室温中放置20分钟酚试剂（ml）0.20.20.20.2马上混匀，放置30分钟，测定A680nm的光吸取值。用A/B/C各管的光吸取值分别减去对比的光吸取值，然后查蛋白质标准曲线，得出每ml稀释样品的蛋白质含量，再计算处A、B、C3种制剂每ml中蛋白质的含量。（2）样品中胰凝乳蛋白酶活力的测定A制备标准曲线，按下表加液。管号12345对比酪氨酸标准液2.02.02.02.02.0水2.00.1mpl/LNaOH2.02.02.02.02.02.0碱性铜溶液2.02.02.02.02.02.0酚试剂0.20.20.20.20.20.2混匀，放置30分钟，测定A6

46、80nm的光吸取值。以光吸取值为纵坐标，酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。B 样品中胰凝乳蛋白酶活力的测定 将上述3种制剂分别pH7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释适当倍数。取4支试管，编号，按下表操作。 管号ABC对比1酪蛋白液（ml）1.01.01.0pH7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液（ml）1.01.01.02.0摇匀，放入25水浴中10min样品（ml）1.01.01.01.0摇匀，连续保温10分钟10三氯醋酸（ml）2.02.02.02.0放置10分钟后过滤。取4支试管，编号，按下表操作。 管号ABC对比 滤液（ml）2.02.02.02.00.1mol/LNaOH溶液（

47、ml）2.02. 02.02.0碱性铜溶液（ml）2.02.02.02.0酚试剂（ml）0.20.20.20.2混匀，放置30分钟，测定A680nm的光吸取值。将各管的光吸取值减去对比管的光吸取值，然后查标准曲线，算出每ml胰凝乳蛋白酶稀释液的活力单位数。(3)计算 比活力胰凝乳蛋白酶活力单位数/蛋白质mg数测定蛋白质含量(参照前面学习蛋白质测定的方法)双缩脲（Biuret）法在碱性溶液中，蛋白质分子能与铜离子结合生成紫红色的化合物（双缩脲反应），在肯定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线形关系。因此可用比色法测定蛋白的含量。 福林酚试剂法： a 福林酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸

48、和磷钨酸的混合试剂b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，蓝色的深浅与蛋白含量质成正比。紫外线吸取法蛋白质中的Tyr、Try在280nm左右具最大吸取，且在各种蛋白质中Tyr、Try含量差别不大，280nm吸取值与浓度具正相关 试验九、聚丙烯酰胺凝胶电泳分别血清蛋白一、 目的1、了解聚丙烯酰胺电泳的基本原理和操作技术。2、把握聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直板/圆盘电泳分别血清蛋白质的方法。了解该电泳的特点及适用范围。二、 原理聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化刘和加速剂的作用下发生聚合反应而制得的。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分别物质。聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用转变凝胶液中单体的浓度来加