DNS法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的研究

1、DNS法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的研究分析检测Vo1.29,No.02,2021DNS法在普鲁兰多糖卷瓣是韩德权,章佳佳(黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080)农品,II鲥妓摘要:普鲁兰是由出芽短梗霉菌株(Aureobasidiumpullulans)发酵生产的胞外多糖,普鲁兰多糖含量多少是判断发酵成功与否的标志,而多糖含量的准确测定对发酵的过程控制特别重要.本文研究了DNS法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的应用,同时研究了色素和不同比例乙醇对DNS法测定出芽短梗霉发酵液中残糖和总糖的影响.结论为色素对总糖的测定有干扰,对上清液中的残糖的测定没有影响;不同比例乙醇对DNS法测定糖含量

2、没有影响.关键词:出芽短梗霉,普鲁兰,DNS法ApplicationofDNSmethodtothedeterminationofsaccharidecontentinPullulanfermentationbrothHANDe-quan,ZHANGJia-jia(CollegeofLifeSciences,HeilongjiangUniversity,Harbin150080,China)Abstract:ThePullulaniSex0poIysaccharides(EPS)producedbyfermentationofAureobasidiumpullulams.Thecontento

3、fPullulansiSanindicationthatthefermentationiSsuccessfuIornot.TheaccuratedeterminationofthePOIvsaccharidecontentiSveryimportanttotheprocesscontroIoffermentation.ThispaperstudiestheapplicationoftheDNSmethodindeterminingsaccharidecontentinPullulanfermentationbrothandtheeffectofpigmentandethanoIindiffer

4、entratioondeterminingresiduaIsaccharideandtotaIsaccharideintheAureobasidiumpuIlulansfermentationbrothwithDNSmethod.TheconclusionwasthatthepigmentinterferesthedeterminationoftotaIsaccharide.buthadeffectonthedeterminationoftheresiduaIsaccharideinthesupernatant.andthedeterminationofsaccharidecontentwit

5、htheDNSmethodwilInotbeaffectedbyethanoIindifferentratio.KeyWOrds:AureobasidiumpuIlulans:Pullulan;DNSmethod中图分类号:TS201.23文献标识码:A文章编号:10020306(2021)020285032006年5月l9日,国家卫生部发布了第8号公告,普鲁兰多糖为新增四种食品添加剂产品之一,它是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)菌体分泌的一种粘性胞外多糖.以d一1,6一糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主,即葡萄糖按d一1,4一糖苷键结合成麦芽三糖,两端再以d一1,6一

6、糖苷键同另#f-的麦芽三糖结合,如此反复连接而成高分子多糖,在食品,医药,轻工业生产等方面具有广泛的应用前景.出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖,发酵液总糖,残糖量是判断筛选菌株,优化发酵条件的重要指标,目前DNS法是发酵液总糖及残糖测定的主要方法之一.本文研究了出芽短梗霉发酵过程中产生的色素以及不同比例乙醇对DNS法测定发酵液总糖,残糖含量收稿日期:20070723作者简介:韩德权(1960一),男,高级工程师,硕士,研究方向:生物制药,保健食品材料.基金工程:哈尔滨市科技局2006年科技创新人才研究专项资金工程(2006RFLXN032),的影响,为出if-短梗霉发酵液糖含量的测定提供了准确的依

7、据.1材料与方法1.1材料与仪器出芽短梗霉黑龙江大学生命科学学院微生物实验室提供;3,5一二硝基水杨酸上海化学试剂采购供给五联化工厂,含量98.0%;苯酚天津市东丽区天大化学试剂厂,分析纯;亚硫酸钠浙江省永嘉县化工试剂厂,分析纯;氢氧化钠天津市东丽区天大化学试剂厂,含量96.0%;酒石酸钾钠天津石英钟厂霸州市化工分厂,分析纯;葡萄糖天津市瑞金特化学品,分析纯;乙醇莱阳市双双化工,含量为95%.UV-755B紫#f-可见光光度计上海精密科学仪器;电子分析天平梅特勒一托利多仪器(上海);高速冷冻离心机美国Sigma公司;电热恒温培养箱DNP一9082型七海精宏实验设备;空气浴振荡器HZQC型哈尔滨

8、市东明医疗仪器厂.食品,业斜枝SdenceandTechnologyofFoodIndustry1.2溶液配制1.2.1DNS的配制将6.3g3,5一二硝基水杨酸和262rnL2molNaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶苯酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮存于棕色瓶中1周后稳定,备用.1.2.21rag/rnL葡萄糖标准液的配制准确称取80C烘干至恒重的分析纯葡萄糖1OOrng,置于小烧杯中,加少量纯洁水溶解后转移到lOOrnL容量瓶中,用纯洁水定容至lOOmL,混合均匀,4C冰箱中保存备用.1.3实验方法1.3.1葡萄糖标准

9、曲线的制备取8支25mL容量瓶编号,按表1分别参加浓度1mg/mL的葡萄糖标准液,纯洁水和3,5一二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反响液.表1葡萄糖标准曲线制作将各管摇匀,在沸水浴中煮沸15min显色,冷却后用纯洁水稀释至25mL,颠倒混匀.用uV一755B型分光光度计在550nm下比色,以0号管为对照液调零点,测出17号管的光密度值.以光密度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,绘制葡萄糖标准曲线.1.3.2总糖和残糖含量的测定取样品溶液1mL,参加3.OmL配制好的DNS试剂,混匀后在沸水浴中煮沸15min显色,冷却后用纯洁水稀释至25mL,颠倒混匀.用uV一755B型分

10、光光度计在550nm下比色,测定A值.1.3.3不同比例乙醇葡萄糖的制备配制乙醇含量不同的水溶液,使乙醇与水的比例分别为1:1,2:1,3:1.称取80C烘至恒重的1.Og葡萄糖,分别定容于lOOmL上述不同乙醇含量的溶液中.对照品称80C烘至恒重的1.Og葡萄糖溶于lOOmL纯洁水中.DNS法测定葡萄糖浓度,每样重复3管.1.3.4DNS法稳定性实验取1.3.3中对照1,分别放置10,20,30,40,50,60min,测定光密度A值,考察放置时间对测糖结果的影响.1.3.5发酵液中粗多糖的提取取经过沸水浴灭活的发酵液50mL,12000r/min离t2,lOmin去除菌体,然后取上清液5m

11、L,分别用1,2,3倍体积乙醇4C过夜沉淀多糖,12000r/min离t2,lOmin去除上清,80C烘干,称重.1.3.6黑色素光密度测定取灭活发酵液稀释150倍,醇沉淀上清稀释20倍,纯洁水作对照,550nm下分析检测测光密度A值,考察色素对糖测定的影响.2结果与讨论2.1葡萄糖标准曲线的制备见图1.0.670.5魏.0.2l0葡萄糖含量(mL)图1以葡萄糖为标准品制定标准曲线以葡萄糖为标准品制定标准曲线,Y=0.6114x一0.0376,曲线相关系数R=0.9985,说明以葡萄糖为标准品在0.41mg/mL范围内可用于糖含量测定.2.2乙醇对DNS法测定糖含量的影响10.og/L不同乙醇

12、比例的葡萄糖溶液,以及10.0L葡萄糖水溶液的糖含量测定结果见表2.数据说明,当纯洁水与乙醇比例为1:1,2:1,3:1时,DNS法测得葡萄糖浓度与实际值根本一致.表2不同比例乙醇葡萄糖溶液含量测定结果2.3放置时间对测糖结果的影响放置时间对测糖结果的影响如图2所示,由图2可知,采用DNS法测定糖含量在30min以内测定比较好.0.280.2780.2760.274<0.2720.270.2680.266时司(rain1图2DNS法稳定性实验结果2.4不同比例乙醇沉淀多糖的比拟发酵液取5mL分别用1,2,3倍体积乙醇4C过夜沉淀多糖,12000r/min离心10min去上清,50

13、C烘干,称重.每样重复3管,取平均值,结果见表3.数据说明,1,2,3倍体积乙醇沉淀多糖的效果是同样的.从节约的角度考虑,我们选择1倍的体积乙醇来沉淀多糖.表3不同比例乙醇沉淀多糖(下转第290页)农品摹业斜枝ScienceandTechnologyFoodIndustry表8DON三种检测方法结果比拟分轿检测3结论本研究对DON的三种检测方法进行了探讨,并确定了它们的检测参数,三种检测方法的检测结果如表8所示.从表8中可以看出,HPLC检测方法的加标回收率较低,提取方法有待进一步改善,虽然其检测的精密度较高,但此方法耗时太长,需要2d左右,且前处理比拟麻烦;ELISA检测方法的最低检出限较低

14、,灵敏度最高,但该方法的检测步骤较繁琐,需要屡次洗涤;金标检测方法的加标回收率和精密度都较好,其最低检出限较前两种方法都低一些,但该方法前处理比拟简单,只需30min就可以出现肉眼可见的结果,简便,快速,适用于现场快速检测的要求,是未来检测方法开展的必然趋势.参考文献:1BergsjoB,MatreT,NafstadI.EffectsofdietswithgradedlevelsofdeoxynialenolonperdormanceingrowingpigsJ.ZentrablVeterinanofMed,1992,A39:752.2朱孟丽.高效液相色谱法对谷物中呕吐毒素的测定J.粮食与饲料

15、工业,2005(8):42-43.3LisaMCahill,ScottCKruger,BrianTMcAlice,CatherineSRamsey,ReginaldoPrioli,BarbKoh.QuantificationofdeoxynivalenolinwheatusinganimmunoaffinitycolumnandliquidchromatographyJ.JournalofChromatographyA,1999,859(9):23-28.4倪梅林,殷居易,曹苏仙,李佐卿.2种检测粮食中呕吐毒素的免疫技术比拟J.安徽农业科学,2006,34(14):3416,3449.5邓舜洲

16、,游淑珠,许杨.脱氧雪腐镰刀菌烯醇酶联免疫检测方法的建立J.食品科技,2006(8):223-224.6SvlciaVL,PhillipsTD,ClementBA,eta1.Determinationofdeoxynivalenol(vomitoxin)byhighperformanceliquidchromatographywithelectrochemicaldetectionJ.JChromatogr,1986,362(1):79-85.7Bondyg,PestkaJJ.ImmunomodulationbyfungaltoxinsJ.JournalofToxicologyandEnvir

17、onmentalHealthPartB,2000,146(3):109143.hihil.hJriIihilIh,h(上接第286页)2.5色素对总糖和残糖测定的影响出芽短梗霉连续3批发酵,发酵液用纯洁水稀释150倍,同体积冷乙醇沉淀普鲁兰多糖.上清纯净水稀释20倍,测定色素,纯洁水作对照550nm下测光密度A值,结果见表4.数据说明,发酵液总糖,残糖稀释至DNS法测糖浓度标准曲线O.41mg/mL范围内,总糖的色素的A值不接近O,残糖的色素的A值接近O,说明色素对总糖的测定有影响,而对残糖的测定没有影响.表4色素对总糖,残糖的影响3结论3,5二硝基水杨酸与复原糖共热后被复原成棕红色氨基化合物

18、,于550nm处有最大吸收,在一定范围内复原糖的量与反响液的颜色强度呈线性关系.该方法具有快速省时,操作简单方便,试剂消耗少等优点,准确度也能到达分析要求,并且能用于半微量或微量分析.在1,2,3倍体积乙醇沉淀多糖的效果一致时,采用1倍体积乙醇来沉淀多糖,比拟节约乙醇.DNS法对不同比例乙醇葡萄糖溶液的糖含量的测定结果说明,乙醇对DNS法测定糖含量的干扰比拟小.出芽短梗霉在发酵产生普鲁兰多糖的同时还分泌黑色素,稀释到DNS法测糖标准曲线范围,色素对总糖的含量测定有影响,不利于总糖的测定,而色素对残糖的含量测定没有影响.因此,可简便地采用DNS法对出芽短梗霉发酵液残糖进行测定,对总糖的含量测定需作一定的矫正,具体矫正因子确实定还有必要做进一步的研究.参考文献:1中华人民共和国卫生部公告2006年第8号J.中国食品添加剂,2006,7(4):168.2BradleySCampbell,AbuBakerMSiddique,BarbaraMMcDougal1.WhichmorphologicalformsofthefungusAureobasidiumpu