WESTERN BLOT protocal

1、 蛋白质免疫印迹(Wsetern blot)一、实验原理：Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。 首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离，然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应，只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第

2、二抗体的待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物上是通过电转移仪器完成的。它是将固体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二者结合在一起，然后将外面二侧用Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治”结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。二、实验操作：1、操作总流程： 蛋白质提取及浓度测定配胶电泳转膜封闭一抗孵育二抗孵育显色2、抗体及试剂准备：2.1 抗体准备：目标蛋白分子量大小建议浓度来源Integrin 5predicted band size:115kDa Observed band size:19,150kDa

3、1:1000-1:10000RabbitIntegrin 9predicted band size:140kDa Observed band size:114kDa 1:1000-1:10000RabbitBeta-actin42 kDa1:5000Mouse2.2试剂配制： 蛋白裂解液M-PER（Mammalian Protein Extration Reagent prod#78501 thermo pierce）8F 海尔，加入1:100-1:1000浓度（开始浓度常用1:200）的蛋白酶抑制剂Protease Inhibitor Cocktail Set III，EDTA-free（M

4、 calbiochem cat.No.539134）5F 细胞房-20冰箱。亦有人使用PMSF、RIPA buffer溶液裂解蛋白。2.2.2 分离胶和浓缩胶的配方：2.2.2.1 M Tris-HCl（pH6.8），用于分离胶的配制。8F小冰箱（成品）。50ml：3g Tris-base加灭菌水约30ml，用盐酸缓缓调pH至6.8，定容至50ml，4保存。2.2.2.2 M Tris-HCl（pH8.8），用于浓缩胶的配制。8F小冰箱（成品）。50ml：9.08g Tris-base加灭菌水约40ml,用盐酸缓缓调pH至8.8，定容至50ml，4保存。.3 30% acrylamide（丙稀

5、酰胺贮液，单体Acr-Bis，30% ）8F ，有成品，有毒！8.76g acrylamide, 0.24g N, N-methylene-bisacrylamide(亚甲基双丙烯酰胺)，加少许灭菌H2O搅匀，最后定容至30 ml，滤纸过滤后4保存。.4 10%SDS 有，自己配制，粉末有毒！5g SDS+50 ml H2O，(难溶，可加热溶解)，常温保存。.5 10%APS （ammonium persulfate，过硫酸铵）自己配制，5楼黄色柜子,现配好的置于8F-20第二层，没有需要重新配制。有建议保存时间为1周。现在都是用很久之前钦策配制的-20的AP。1g APS +10ml H2O

6、，溶解后分装成100ul每管4C保存。.6 分离胶：溶液成分不同体积凝胶液中各成分所需体积（ml）5（一块胶）10152025306%ddH2O2.65.37.9 10.613.215.930% acrylamide！1.02.03.0 4.05.06.01.5mol/lTris(PH8.8)1.32.53.8 5.06.37.510%SDS0.050.10.15 0.20.250.310%过硫酸铵（APS）！0.050.10.15 0.20.250.3TEMED！0.0040.0080.0120.0160.020.0248%ddH2O2.3 4.6 66.9 9.311.513.9 30%丙

7、烯酰胺溶液！1.3 2.7 54.0 5.36.78.0 1.5mol/lTris(PH8.8)1.3 2.5 3.753.8 5.06.37.5 10%SDS0.05 0.1 1500.15 0.20.250.3 10%过硫酸铵（APS）！0.05 0.1 1500.15 0.20.250.3 TEMED！0.0030.006 150.0090.0120.0150.01810%够ddH2O1.94.05.97.99.911.930%丙烯酰胺溶液！1.73.35.06.78.310.01.5mol/lTris (PH8.8)1.32.53.85.06.37.510%SDS0.050.10.15

8、0.20.250.310%过硫酸铵（APS）！0.050.10.150.20.250.3TEMED！0.0020.0040.0060.0080.010.01212%ddH2O1.6 3.3 4.96.68.2 9.930%丙烯酰胺溶液 ！2.0 4.0 6.08.010.0 12.01.5mol/lTris(PH8.8)1.3 2.5 3.85.06.3 7.510%SDS0.05 0.1 0.150.20.25 0.310%过硫酸铵（APS）！0.05 0.1 0.150.20.25 0.3TEMED！0.0020.0040.0060.0080.010.01215% ddH2O1.1 2.3

9、3.44.65.76.930%丙烯酰胺溶液 ！2.5 5.07.510.012.515.01.5mol/lTris(PH8.8) 1.3 2.53.85.06.37.510%SDS 0.05 0.10.150.20.250.310%过硫酸铵（APS）！0.05 0.10.150.20.250.3TEMED ！0.0020.0040.0060.0080.010.012.7 5%浓缩胶：溶液成分不同体积凝胶液中各成分所需体积（ml）12（一块胶）3456ddH2O0.681.4 2.12.7 3.44.130%丙烯酰胺溶液！0.170.330.5 0.67 0.831.01.0mol/lTris(

10、PH8.8)0.130.250.380.50.630.7510%SDS0.010.020.03 0.040.050.0610%过硫酸铵（APS）！0.010.020.03 0.040.050.06TEMED！ 0.001 0.002 0.003 0.0040.0050.006 0.015利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离主要依据以下两个因素： 蛋白质所带静电荷：在不同的pH条件下蛋白质所带电荷不同。在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。其次，蛋白质的形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻力主要取决于样

11、品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。蛋白质分子越小或凝胶网孔越大，所分离样品所受阻力就愈小，则在电场中的迁移率就越大。在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。电压 x 样品静电荷迁移率 = 摩擦力浓缩效应可显著提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。它是由较低浓度的丙烯酰胺构成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。 另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。浓缩胶内的

12、缓冲溶液是Tris-HCl（pH 6.7）,该pH远低于Tris的pK值(8.1)。分离胶内的缓冲溶液是pH 8.9的Tris-HCl，而电泳正负两极的缓冲溶液均为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中，小分子并带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。当样品进入pH 8.9的分离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时的蛋

13、白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。SDS-PAGE最佳分离范围：一般都使用10%的胶，胶浓度越小越容易碎。最好遵循这个做。6%胶 50-150kD 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-406% kD8%胶 可以做到一百多的分子量 10%胶(小于100的用这个就够)2.2.3 5Sample/loading buffer 双向电泳样品缓冲液（1:1） 名称质量/体积备注（暂放位置）0.5M Tris(pH6.8)5 ml SDS1 g甘油 (Glycerol)3 ml 巯基乙醇 (2-mercaptoethanol)0.5 ml 1%溴

14、酚蓝 2 mg 总计10ml 避光4C保存。0.1%溴酚蓝（Bromophenol）10 ml BR，5F黄色柜子最右边，用于5Sample buffer配制。溴酚蓝10mg加ddH2O至10ml，搅匀溶解，过滤除去未溶颗粒。现在有现成的loading buffer，8F的9号冰箱-20，黄色盒子。蛋白：5loading buffer=4:1。2.2.4 SDS-PAGE电泳液（Running buffer）自己配制，4保存。名称质量/体积备注（暂放位置）Tris base3 g甘氨酸 (Glycine)14.4 g5F黄色柜子SDS1 gddH2OTo 1000 ml2.2.5 半干转移缓冲

15、液转膜液（transfer buffer） 8F有，10transfer buffer 稀释可直接用，4保存。名称质量/体积备注（暂放位置）Tris base3.03 g甘氨酸 (Glycine)14.48 g5F黄色柜子甲醇250 mlddH2OTo 1000ml 湿法转移缓冲液（又称电转缓冲液、转模缓冲液，可在烧杯中配制，有10转膜缓冲液成品（PW003 EZ-Buffers C 10XWestern Transfer Buffer (no methanol)），稀释为1后可以加入甲醇使用，甲醇最后添加，防止挥发，分子量大的蛋白需要20%甲醇，分子量小的蛋白需要10%即可）。名称质量/体积

16、备注（暂放位置）Tris base5.8 g甘氨酸 (Glycine)2.9 g甲醇200 mlSDS0.37 gddH2O To 1000 ml 10丽春红染液（用于染膜，可用清水洗掉）8F桌上（成品，1直接使用），可回收。名称质量/体积备注（暂放位置）丽春红S2 g三氯乙酸30 g磺基水杨酸30 gddH2O100 ml使用时将其稀释10倍 TBST（Tris Buffered Saline）自己配制（不同配方稍有出入）：按10TBS配，最后使用时加入Tween20，以下所有Tween20为100%，一般情况为准确性先将Tween20首先配制为25%。有建议TBS放置4保存。名称质量/体积

17、备注（暂放位置）Tris base3 gT1503 ？氯化钠8 g氯化钾0.2 gddH2OTo 1000 mlTween20（吐温20）0.5 ml8楼木柜子 PBST（可代替TBST，用来洗涤，Tween20浓度为万分之五）自己配制（不同配方稍有出入）名称质量/体积备注（暂放位置）10PBS100 ml8楼ddH2OTo 1000 mlTween20（吐温20）0.5 ml25% Tween20加2ml 染胶液（蛋白染液）现有是black的Q250 目前都没有染。 100mg Coomassie Brilliant Blue G 250（考马斯亮蓝有）溶于50ml 95%的乙醇，加入100

18、ml 85%的H3PO4,及50mlddH2O, 4保存于棕色瓶中。 胶脱色液 for Coomassie Brilliant Blue 自己配置 膜可用清水洗脱，时间较久名称质量/体积备注（暂放位置）冰乙酸（acetic acid）100 ml 甲醇（methanol） 100 mlddH2O To 1000 ml 3、操作步骤：3.1 蛋白提取 （要点：注意保持低温，防止蛋白降解）3.1.1 提前打开冷冻离心机，使其降温到4。 将细胞培养基倾去，预冷PBS洗1-3遍，蛋白酶消化培养瓶或培养中的细胞消化，离心1000转/min，5min，用PBS清洗1-2次后再离心1000转/min，5mi

19、n。加入0.5ml的含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液M-PER（蛋白酶抑制剂：蛋白裂解液M-PER=1：100-1:1000，经典工作初始浓度为1:200。加入量：T25培养瓶，），并强烈吹打后置于冰上摇床晃10-15min(有建议是30min)，期间最好可剧烈震荡3-4次，使蛋白充分裂解。3.1.3 若为膜蛋白，建议用预冷PBS洗1-3遍后，将液体充分吸干后，加入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液M-PER3.1.4 离心4，12000g，30min。取上清，不要吸到沉淀物（细胞膜碎片或核酸或未裂解的蛋白）。分装后放入-20备用。分装的蛋白量最好是根据浓度分配，否则就30-50/管。3.2 测蛋白浓度 考

20、马斯亮蓝（R-250）测定法：按0、100、200、400、600、800、1000ng/ul的浓度配制标准曲线，为减少加样误差，可适当增加标准品配制的体积，并将提取的蛋白样品按适当的比例稀释（1:20至1:50），将标准曲线样品和待测样品加入到干净的96孔板中，每个10ul，然后加入100ul提前配好的考马斯亮蓝（R-250），轻轻晃动混匀即可用酶标仪测定，发射波长为595nm。 BCA试剂盒测定（有，8F海尔）：具体参考BCA试剂盒说明书操作。标准品的配制：标准品（Albumin Standard prod#23209 Lot# MF 19421：sourcebovine serum al

21、bumin 2.0mg/ml 1支1ml）。用PBS配制，准备7个1mlEP管（标注好相关浓度：2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0mg/ml），将后面6管加入500ul的PBS，将标准蛋白1ml吸入第一个EP管中，然后将第一个EP管中500ul液体吸入第二个EP管，混匀后，将第二个EP管中的蛋白吸入第三个EP管，如此类推，直至将第五个EP管中的液体500ul吸入第六个EP管中混匀为止。可分装，100ul/管，置-20存放。正式操作：准备A+B混合液，比值为1:50，两位（7个标准蛋白孔+目标蛋白数量2副孔+12）200ul/孔。最好置于冰上，配完4保存。准备一个96孔板，最

22、好不是培养细胞经过处理的（最好的是国产），将配制好的不同浓度标准品10ul分别吸入孔板的孔内，并吸入目标蛋白（一般需要1ul结果放大10倍，浓度低时可以吸入2ul结果放大5倍），每种目标蛋白2个副孔。将A+B混合液吸入每个孔内，200ul/孔。加样完成后37反应30min，然后用酶标仪测定，波长为562nm或595nm（我们现在用570nm）。用EXCEL制作标准曲线，求蛋白浓度。2.2 上样蛋白制备：蛋白浓度测定之后，计算好上样蛋白的体积（一般15-40ug蛋白为宜，使用10ug），取一定量的蛋白样品，加上5loading buffer，100的金属浴煮10min，然后置于冰上待用。如需保存

23、可放置在-20存放1-2个月。2.3 电泳及转膜 清洗电泳所用的玻璃板，晾干或吹风机吹干； 装置电泳玻璃板（长板在内短板在外）并用制胶用绿色塑料板固定（卡住），注意玻璃板的下沿要对齐，否则容易漏胶； 配胶（配方见试剂配制） APS 和TEMED要最后用时再加，混匀，每边用枪从板左上角加入4ml，枪头内胶不要全推出，即再吸再加入，防止出气泡，加胶比5cm的刻度线稍高，用去离子水滑行方式加满覆盖压住胶（只在一角加入可能会使胶面不平），等待约20min使其凝固（上层水与凝胶之间出现折光面），除去水层，并用滤纸吸干残留的水分。加满浓缩胶，立即插上梳子，注意梳子的规格要与玻璃板的规格配套，1mm的玻璃板

24、对应1mm的梳子，0.75mm的玻璃板则用0.75mm 的梳子，最好选择两头小齿完整的梳子，平整面朝向长玻璃板，注意不要有气泡；等30min左右，胶凝后可见齿边缘与胶有空隙。 上样电泳 放好电泳槽，将制好的胶板反过来（短面在内，如果跑单面胶，则放置好胶板后，另一面放塑料板，字面向内，夹紧），外加旧缓冲液Running buffer，两板之间加入新缓冲液Running buffer，然后拔掉梳子，拔梳子时要垂直向上慢慢拔出。上样，100V，20min，再200V，45min。(80v 30min)(100v 60min)（浓缩胶一定要跑完才可以变电压再跑分离胶）。溴酚兰快达底部即可停止电泳。 染

25、胶（选做）：用染胶液(考马斯亮蓝)染色约30min（摇床）后用Destain脱色液脱色2h，并于凝胶成像中观察)。 转膜 PVDF 膜预处理：用甲醇浸泡1min(3-5秒)转膜液浸泡2min； NC膜（nitrocellulose membrane，硝酸纤维素膜）（8.55.5cm）直接用转膜液浸泡2min； 切4张8.85.8cm滤纸,与海绵垫均用转膜液浸泡5min；切除浓缩胶（记清方向及要剪下染全蛋白的膜长度）； 夹子黑色面+海绵（聚乙烯板）+滤纸+凝胶+NC 膜（不分正反面）+滤纸+海绵+夹子白色面（如图1所示），注意每放一层用玻璃棒赶一次气泡，并要始终保持湿润，否则胶易碎，一定要赶净气泡，否则会产生高背景或影响蛋白转移；将三明治固定在转膜槽