中空纤维膜液相微萃取高效液相色谱法测定HPLC测定穿心莲路边青配伍

1、中空纤维膜液相微萃取-HPLC法测定复方穿心莲片中脱水穿心莲内酯含量*付华峰 关继禹 曲志爽 包建民*（天津大学药物科学与技术学院，天津，300072）摘要 目的：建立一种新方法中空纤维膜液相微萃取-高效液相色谱法测定复方穿心莲片中脱水穿心莲内酯的含量。方法：将样品用甲醇浸泡、超声、过滤后, 配成样品溶液。经用装有正辛醇的中空纤维膜进行液相微萃取后，用HPLC法测定复方穿心莲片中脱水穿心莲内酯的含量。结果：脱水穿心莲内酯在100 8000 ng·mL-1 浓度范围内线性关系良好，其加样回收率大于96.0，RSD < 4.0%。结论：通过液相微萃取后，能有效地去除检测复方穿心莲片

2、中的干扰物质，样品处理无需经过中性氧化铝柱纯化，获得了较高的选择性。该方法简便、快速，灵敏度与不经过液相微萃取相比液相色谱方法提高约133倍，是测定复方穿心莲片中脱水穿心莲内酯的含量的一种好方法。关键词 中空纤维膜液相微萃取 脱水穿心莲内酯 高效液相色谱 复方穿心莲含片 正辛醇Determination of Dehydroandrographolide in Fufang Chuanxinlian Pian by Hollow Fiber Solvent Microextraction- HPLCFU Hua feng,GUAN Ji yu, QU Zhi shuang, BAO James

3、 J. （College of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin, 300072）Abstract Objective: To develop a new method for the determination of the content of dehydroandrographolide (DAP) in Fufang Chuanxinlian Pill by high performance liquid chromatography following hollow fiber sol

4、vent microextraction. Method: The sample was immersed in methanol under sonication. Then a hollow fiber containing octanol inside was placed in the sample solution to perform microextraction. The extracted sample was analyzed by HPLC with UV detection . Results: The calibration curves of DAP were li

5、near from 100 to 8000 ng·mL-1. The method recoveries were over 96.0% with RSD less than 4.0%. Conclusion: By using hollow fiber based microextraction, interference for the determination of dehydroandrographolide was eliminated effectivelyThis method is specific, simple，fast，sensitive and suitab

6、le for the determination of DAP in complex tablet with little solvent consumptionKey Words hollow fiber solvent microextraction dehydroandrographolide HPLC octanol1.1 装置 图1 中空纤维膜液相微萃取装置图Fig 1 Apparatus of hollow fiber membrane solvent microextraction1.2原理 液相微萃取原理与液液萃取原理是一致，药物在水相和有机相之间平衡是热力学平衡，当萃取达到平

7、衡时，样品在水相和有机相中的化学势相等。， ， 在一定 T, p下， 为常数。= P 为常数。其中, , , 分别为待测物在水相和有机相的化学势及标准化学势。P 为分配系数。当萃取达到平衡时，有机相中药物浓度就是水相浓度的P倍。在微萃取中，因为有机相与水相的体积比很小，萃取过程对水相药物浓度变化不大，从而实现药物浓度的富集。2. 仪器和试药高效液相色谱仪包括ConstaMetric 4100 泵， Waters 486检测器，Chrom Perfect 数据采集和处理系统。S21-2恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）。脱水穿心莲内酯对照品（中国药品生物制品检定所），复方穿心莲片(广西圣特药

8、业有限公司，批号20040320)，正辛醇（天津市博迪化工有限公司），甲醇（色谱纯，康科德试剂有限公司），磷酸氢二钠（天津大学科威公司），磷酸二氢钠（天津市天河化学试剂厂）。聚丙烯中空纤维膜(内径1 mm，壁厚100 m，膜孔径1.8 m,膜孔率60%，天津大学化工学院膜研究所)。试验用水为二次蒸馏水。3. 实验方法3.1 色谱条件实验所用色谱柱为Waters Symmetry C18柱（150 mm ´3.9 mm，5 m）,所用流动相为甲醇和水（体积比60：40），流速为0.5 mL·min-1。进样量为10 L。检测波长为254 nm。3.2 对照品溶液的配制 精密称

9、取脱水穿心莲内酯对照品12 mg，溶于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。对照品溶液的浓度为0.24 mg·mL-1。3.3 样品溶液的制备取复方穿心莲片20片，用水洗去糖衣，在 鼓风干燥2小时后，精确称量为4.1267 g，研细，置于锥型瓶中，加甲醇100 mL，密塞，浸泡24小时，超声30 分钟后过滤。滤液在水浴上蒸发部分甲醇，最后定容于2O mL容量瓶中。取部分溶液，用0.45 m尼龙滤膜过滤，作为样品溶液。3.4 液相微萃取试验将中空纤维膜截断成约8 cm的小段，用甲醇将中空纤维膜小段洗三次，除去中空纤维膜表面的杂质，干燥除去甲醇。在中空纤维小段中加入30 L的

10、正辛醇，两端封死。在8 mL的瓶中，加入适量的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液, 加入适量的对照品溶液和适量的水，使最后体积为7 mL。在25和常压下，将装有正辛醇的中空纤维膜小段置入溶液中，启动电磁搅拌器，搅拌速度保持为中速，萃取60分钟后，将装有正辛醇的中空纤维膜小段取出，从中取10 L萃取液，用高效液相色谱进行分析。4. 结果与讨论.4.1 药物溶液pH对液相萃取的影响药物溶液pH会影响药物在水相的化学势，进而影响药物在两相中的分配平衡。从图2脱水穿心莲内酯色谱面积随着pH变化曲线可以看出，随着pH增加峰面积略有增加，表明药物溶液pH对液相微萃取有影响，但影响不大。在比较低pH值，色谱峰有

11、明显的拖尾，峰形不太好。本试验选取的缓冲液为 0.2 mol·L -1 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(pH =7) 缓冲液。图2 药物溶液pH对液相微萃取的影响，药物浓度为800 ng·mL-1Fig 2 The effect of buffer pH on the hollow fiber membrane solvent microextraction, the concentration of dehydroandrographolide 800 ng·mL-14.2 萃取时间的影响在一定温度（T）和压力（p）下，只有药物在两相达到相平衡时才有固定的分配常数。药物

12、在两相中分配需要一定的时间，本文考察在微液相萃取达到平衡的时间。在电磁搅拌情况下，从图3可以看出，在40分钟之前，药物在正辛醇相中的浓度随时间的增加而增加。在40分钟之后，药物在两相中的达到平衡。为了确保每一次测定都是在萃取平衡的条件下进行的，本实验选取的萃取时间为60分钟。图3 萃取时间的影响，药物浓度800 ng·mL-1Fig 3 The effect of time on the hollow fiber solvent microextraction, the concentration of dehydroandrographolide 800 ng·mL-1.

13、 4.3 液相微萃取对脱水穿心莲内酯富集情况的考察在6.79 mL的磷酸缓冲液（pH=7）加入210 L的对照品溶液，浓度为8 g·mL-1。精密取10L进样，记录脱水穿心莲内酯的色谱峰（图4 B）。在该溶液中放入装有30 L正辛醇的中空纤维膜，萃取60分钟后，精密取10 L进样，记录脱水穿心莲内酯的色谱峰（图4 A）。A峰的峰面积是B峰峰面积的133倍。图4 脱水穿心莲内酯对照品溶液的色谱峰；A 峰为液相微萃取后穿心莲内酯的色谱峰；B峰为液相微萃取前穿心莲内酯的色谱峰Fig 4 HPLC chromatograms of solution of reference substanc

14、e of dehydroandrographolide. A. the chromatography peak of the dehydroandrographolide in the octanol phase after solvent microextraction. B. the chromatography peak of the dehydroandrographolide in the water phase before solvent microextraction4.4 线性范围精密量取3，4.4，5.8，10.6，21.2，42.4，84.8，168.6，210 L对照品

15、溶液，加入适量的pH= 7的0.2 mol·L -1 磷酸缓冲液稀释为7 mL，制备成浓度为 100，150，200，400，800，1600，3200，6400，8000 ng·mL-1 对照品溶液。在中空纤维膜中加入30 L的正辛醇，萃取60分钟后，取10 L 萃取液液进样，记录色谱峰（见图5A）。以峰面积及分值Y为纵坐标，以水相药物溶液浓度X （ng·mL-1）为横坐标，得回归方程为：Y = 2947.8 X -112915.1(r = 0.9988) 表明脱水穿心莲内酯在100 8000 ng·mL-1 浓度范围内成具有良好线性关系。 A B图5

16、 对照品(A)与样品（B）色谱峰Fig 5 HPLC chromatograms of solution of reference substance (A) and solution of sample of dehydroandrographolide4.5 精密度试验精密取2 mL样品溶液，用甲醇定容于100 mL容量瓶中。分别取200 L样品溶液，依次加入6个装有6.8 mL 磷酸缓冲液(0.2 mol·L -1, pH= 7)小瓶中，分别放入装有30 L正辛醇的中空纤维膜。萃取60分钟后，分别取萃取液10 L 进样，记录色谱峰（见图5 B）脱水穿心莲内酯峰面积RSD为 1.

17、1%。4.6 加样回收率试验 分别取200 L已知含量的样品溶液，在装有6.8 mL磷酸缓冲液(0.2 mol·L -1 , pH= 7) 小瓶中，依次加入5.8，8.7，10.6，13.5，16.4 L对照品溶液。按本文实验方法测定脱水穿心莲内酯的含量。计算回收率，结果见表1。表1 回收率测定结果（n = 3）Tab 1 Test results of recovery加入量(added) /ng·mL-1测得量(found) /ng·mL-1平均回收率(average recovery)/%RSD（n = 3）/ %200.0194.697.33.3400.0

18、398.299.63.8600.0584.097.33.5800.0767.996.03.71000.0963.196.32.04.7样品测定 分别精密量取200 L稀释50倍后的样品溶液，依次加入适量磷酸缓冲液(0.2 mol·L -1 , pH =7) 稀释为7mL，液相微萃取60分钟后，分别取10 L萃取液进样。记录样品中脱水穿心莲内酯色谱峰面积，根据线性关系计算样品的含量，三次测定结果为0.63 mg·tablet -1，0.65 mg·tablet -1，0.66 mg·tablet -1。5.结论参考文献1 Chp(中国药典)2 Chp(中国

19、药典)2000.5413 CAI Wen-tao(蔡文涛), HAN Feng-mei(韩凤梅). RP-HPLC determination of dehydroandrographolide in Andrographis and Clerodendron compatible preparation in mice plasma(RP-HPLC测定穿心莲、路边青配伍药液中脱水穿心莲内酯在小鼠血浆中的浓度). J. Hubei Univ(湖北大学学报), 2005, 27 (1) :744 WU Fu-hai（毋富海）, LI Guang-xi（李光喜）, LIANG Han-ming（梁

20、汉明）, et al. Determination of andrographolide and 14-deoxy-11，12-didehydroandrographolide in compound Chuanxinlian tablets by HPLC(HPLC测定复方穿心莲片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量).W C J.P S（华西药学杂志），2004，19（2）：135 5 XU Doulai(徐东来). Determination of 14-deoxy-11，12-didehydroandrographolide in XIAOYANG LIDAN TABLETS by TL

21、C-scanning(薄层扫描法测定消炎利胆片中脱水穿心莲内酯含量). Chin Tradit Pat Med(中成药)，2002，24（2）：996 Przyjazny A,Kokosa J M. Analytical characteristics of the determination of benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes in water by headspace solvent microextraction. J Chromatogr A, 2002, 977 (2):1437 Jager L S，Andrews A R J. Development of a screening method for cocaine and cocaine metabolites in urine using solvent mi