笔记三十六策第18策利器全文

1、三十六策 第 18 策 利器酸菜今天我们来到了三十六策第三章“始制有名”的最后一讲，也是整个三十六策上半部分收官的一策。经过一段时间艰苦的学习，我相信大家多多少少能感觉到比之前的有明显的进步过一句话我蛮喜欢的：未来的你一定会感谢现在努力奋斗的。来！干完这碗鸡汤，让我们开始学习第 18 策“利器”。这一策我们要讲一讲生物数据库和生物信息学软件在基础科研中应用，俗话说：工欲善其事，必先利其器。这些生信工具是科研的利器，有效利用能大幅提升你的研究效率。当然工具也并不是越多越好，太多会“乱花渐欲迷人眼”，不知不觉中带偏。我听说过一个故事，很有启发意义。有位兄弟比较喜欢，第一次去的时候推门进来一个，感觉

2、不错，后面就经常光顾。有时候来的是护士，有时候是，有时候是空姐，直到有一天来一个女，他嗷的一声就扑了上去，结果悲催了，这是个真。温水煮青蛙，很容易使人对丧失力。生信工具给人的错觉是好像拥有了工具就能够科研数据的世界，很遗憾！这绝对是假象。在过去的几年里我看到一些纯生信套路的文章被人开发出来，从最开始发 10 来分到后续复制的迅速跌到三五分，然后再滑落到一两分，中间就是隔个两三年而已。生信的套路更新迭 代非常快，快到你刚学会，它就差不多要过时了。开发套路的是大神，一般人还达不到。跟 风的也需要追得紧，等后知后觉凑上来，那这些套路的性价比已经非常低了。我们学员当中有一部分已经经历过生信灌水的阶段，

3、他们共同的感触是套路虽好但有局限性，想科研长久走下去，回过头来还是得返璞归真，研究机制的这套体系。在初学者中，有相当一部分同学觉得发不了 SCI 是因为生信的套路，像歌里唱的：得不到的永远在，被偏爱的都有恃无恐。既然大家很想学，我们肯定要教，但在 36 策这门基础科研的策略课里，我没法关注太多的细节，只能先把如何利用生信工具的思路传输给大家。从上看，生信是一门的学科，能力有三种境界：专业级选手是研究各种算法和架构数据模型的，精通至少一种编程语言，比如现在比较流行的 Python 语言，他们的工作状态跟程序员很接近，光靠编程就可以有一碗饭吃，我们这些业余科研对这种水平恐怕是望尘莫及。退而求其次，

4、第二种境界，做一个生信的资深者，其进入条件是必须掌握R 语言。R 是专门用于统计分析和作图的语言，比编程语言要简单。把 R 玩好了，统计软件和作图工具你就不用学其他的了，而且因为用得人多又是开源软件，有很多现成的扩展插件， 俗称为“包，package”，即一套数据处理的工作流程，人家把代码都写好了，你只要拿过来调一下参数就可以用，非常的高效。当然 R 的难点也恰恰在于包太多了，对新手而言像天书一样，拿到手也用。不管怎么说，R 是数据挖掘的基础，这一层境界是医生在业余时间刻苦学习可以达到的。学习周期大概半年到一年，如果你统计学得比较好，上手就快。要想仅用生信就发 paper，R 语言是必学的。如

5、果你不想专门耗费大量时间学 R，那么所谓的生信分析仅仅是用用现有的数据库和软件工具而已，这是第三层境界，叫业余水平。业余选手是希望点点鼠标就把数据分析给做了，但好的工具都是的，的用不起，的功能又有限。这么一来，人家数据挖掘是挖个大洞，你就只是刨个小坑，输出的数据层次上会比较单薄，单薄到必须要与细胞、动物的数据相配合，才能形成完整的 story。- 1 -其实，对绝大多数搞基础科研的人来说业余水平够用了，生信分析只是一种辅助，掌握一点生信技能可升级成为一个“干湿结合”的双修科研选手。干湿结合是一个行话，科研界把用生信搞研究的策略称为“干实验”，而把细胞生物学研究称为“湿实验”，摆弄瓶自然是干了，

6、这是一种比较形瓶罐罐的细胞和实验确实很湿，跟网吧一样的生信象的比喻。我们不难发现，近几年干湿结合已经成为基础科研的一种常规配置，生信数据分析加上生物学实验验证可以发高水平的 paper。完美的双修肯定是练心经那样的双修，你做生信我做细胞、实验，咱们一起 co 文章，琴瑟和鸣、比翼齐飞。但是现实中往往是周伯通那种左右互搏的双修，一个人要学习两种技能，宝宝心里苦。医生本身要干临床， 同时做科研，即临床科研双修。做科研还要临床研究加上基础研究双修，然后基础科研里还要干湿双修，技能点加得实在有点多，所以杂而不精便成了普遍现象。我个人并不赞同临床研究、生信还有基础的套路都去全方位学习，每一个都包含了海量

7、的知识，需要大量精力投入。在能够合作的情况下，各取克服技能短板才是最有效率的解决问题思路。今天我们重点讲一讲大多数医生做基础科研需要达到的干湿双修的生信业余水平应该掌握哪些技能。生信技能配合基础研究主要有两种应用场景：其一是解决筛、猜获取新变量，也就是 Candidates 的问题。当变量代入恒量找研究靶的时候，你可以通过的数据库对别人用过的高通量数据进行二次挖掘，实现数据的再利用。其二是筛或者猜机制的时候，工具和数据库也可以帮助，指引你研究的这个跟哪些通路、哪些下游能有关联。如果下游有很多都发生变化，还可以构建调控，把复杂的信息可视化变成一张信号通路图。实际上在整个课题展开的过程中也只有两个

8、环节需要筛猜找主变量以及已知主 变量找机制的因变量。两步关键的动作都可以加入生信工具辅助，所以就算不发展到学编程语言这一步，掌握一些必要的数据库和软件使用也是当前形势下做基础科研的基本功。科研和临床完全不同，接触表型的概念觉得不好理解，就是话语体系转换的。在科研里，临床研究、基础研究和生信分析这三套又各自成体系。哪怕是生信领域最简单的数据库使用，很多学员也觉得一下子难以上手。用数据库的诀窍其实就两个字：瞎点！猫大过陌生数据库的学习，跟看法不谋而合把每个能点的按钮都点一遍，把界面里不懂的单词搞懂，一个数据库差不多就会用了。关键还在于各种按钮你随便点，点错了并罚钱。一般数据库还有专门的说明文档，有

9、点耐心仔细读一读，问题就迎刃而解了。有相当一部分同学一说到各种数据库就焦虑的不得了，主要是看到英文界面心里就很抗拒。这归根到底还是懒，就像小孩子如果你一直喂他饭，他可能到五六岁都吃，纯粹是惯出来的毛病。从你做科研的第一天起就要跟英语打交道，同时你也在跟各种各样之前你没有用过但必须要去学习的软件打交道。比如我们平常整理文献用 endnote，pubmed，做序列比对分析的 blast，以及做 PCR 引物设计的各种软件等等。有些是的的，有些可以本地安装，凡是本地运行的都可以理解为软件背后是一套算法，而的工具，部分是算法、部分是存数据的，大量的实验数据组成一个 database，就这两种形式。为了

10、描述方便，我们姑且笼统地都叫“数据库”吧，因为到底是软件算法还是数据集合这个概念在科研界区分并不严格。所有数据库可以按用途分为 4 类：信息数据库、通路数据库、互作数据库和样本数据库。我们在课程的前半段已经提到过不少数据库，如 NCBI 的 Genebank、Nucleotide，查信息的 Genecards，查 miRNA 序列的 miRBase，查 lncRNA 的 noncode，还有 UCSC、Ensenbl查启动子区域信息，ORF Finder 分析一段序列是否编码蛋白，CpG Finder 找 CpG 岛位置等等。凡是跟、非编码 RNA序列或者功能注释相关的数据库，统称为信息数据库

11、，- 2 -就跟面对大量局存个人信息、户籍信息一样，这是的特息。当我们启动一个课题，需要选择的时候，或者已经有一个确定需要检测它表达水平的时候，信息数据库是我们最早用到的一批工具，同时这一类也是使用上最简单的数据库。第二类是通路数据库，其中有大量工具可以用，最经典的有三个：KEGG，DAVID 和 GSEA，这类数据库主要功能是聚类，把相关的一类。人脸识别功能大家知道吧？识别人脸是依靠模型里七八十个特征点的坐标来实现的，一旦所有参数都配上，就是符合的对象。这些通路数据库的聚类功能也是一样，他们把按照功能表型进行了特征归类，当你手上有一份高通量数据输入进去，就可以告诉你研究中变化的跟哪些已知的特

12、征比较相关，并且可以根据已知的间调控构建调控，然后告诉你哪些位于关键的节点。这个节点，术语 Hub gene，翻译成枢纽或者叫节点，换句话说就是提示你哪些关键进行干预，可以有的放矢。通路的信息非常复杂，在你手握高通量数据要进行整体性分析时，这些工具必不可少。第三类数据库是互作数据库，主要用在与间相互作用，也就是直接作用机制。前面讲过 miRNA靶的 Targetscan，转录因子靶的 JASPAR，其他还有很多，比如lncRNA 与 miRNA 结合的 Starbase，蛋白与蛋白相互作用的 String等等，各种类型相互作用都有数据库可以用。大家注意，一旦涉及交互作用的一般同样的功能会有不同

13、科学家开发好几个数据库，背后的算法逻辑和用法都有些差别，你一个个研究是很花时间的。凡是我们课程里推荐的，碑，你没必要神农尝百草。以转录因子的靶是公认好用的，是前人的经验和口为例，除了 JASPAR 还有一个叫TRANSFAC 的数据库，采用了另一种策略来做：集合了大量的 CHIP-seq 实验结果。什CHIP-seq 呢？染色质免疫共沉淀 16 策讲过，如果把 CHIP 实验中通过抗体拉下来的转录因子-DNA 复合物，解离所有的 DN段送去分析，就知道了一个转录因子结合的所有 DNA 序列，那就是 CHIP-seq，seq 就是 sequencing的意思。转录因子毕竟数量是有限的，每个转录因

14、子做一遍 CHIP-seq 不就掌握了大量实验来源的转录因子结合序列信息了吗？这种基于真实实验数据的工具理论上比纯的可靠性要高一些，在有选择的情况下，不要忽略这一类数据库。一些商业公司的往往也提供一些工具，比如 QIAGEN 公司提供了 CHIP 实验后qPCR 验证的预设计引物，每个可能结合的转录因子都好了，连结合位点的结果都有，我是在 Genecards 数据库给的里发现的。还有 SIGMA因的 shRNA 序列都给设计好了，并且是公开的，搞得设计 siRNA 这么一公司把个有难度的活顿时没了技术含量，猫大在她的实验课里面也过具体参照的。最后还有第四类，也是最重要的一类数据：样本数据库。之

15、所以生信分析可以用别人的数据发的文章，别人的数据不是从文献一个个去找，而是有现成的数据中心，就是样本数据库。其中不得不提的典型是GEO，GEO 是NCBI 的一个子数据库，全称叫Gene ExpressionOmnibus。这个数据库了全世界最大、最全面的表达谱数据，是个数据仓库。研究者上传的数据，也可以别人的高通量检测原始数据。全世界那么多做高通量筛选，很多问题重复筛选是浪费的，研究者们共享数据是有利于科学进步的大好事。GEO 什么都有，是个大杂烩。各种常见疾病还有的样本数据库，比如做肿瘤的还有 TCGA、Oncomine、SEER，都我们根据感的问题高通量数据，经过二次分析产生新的结论，。

16、- 3 -经常有学员问：我要做某某疾病，有没有数据库可以用啊？我是授人以渔，不想每次帮捞鱼，所以这里把找数据库的索引目录的比较权威的数据库索引是牛津大学告诉，可以在里面寻宝。第一个的核酸研究杂志（Nucleic Acids Research，NAR），每年发布的数据库特辑（database issue），从 1994 年开始 NAR 就差不多每年要更新一版，当前已经是第 24 版了。NAR database issue 提供了 15 个分类的数据库目录，其中有一个就个数据库索引，叫 Omictools涉及按疾病找数据库。第二个再给大家（类搜，每个数据库都有），这个站点直接提供搜索功能，用起来很

17、方便，也可以按分和简单。不过数据库数量众多，很多作者发了文章之后没有维护基本就等于废了，如果有超过 5 年没有更新，是不是可用大家要加点。在数据挖掘的过程中，统计可谓如影随形。一般的流程，研究者会先通过高通量数据分析筛选出差异，然后会根据临床资料进行单因素、多因素和生存预后等分析操作。在一些文章中，作者会把多个靶标根据评分组成度的模型，这种套路里样本数据至少会随机分成两份，一份 75%，一份 25%，或者七三分。多的那份数据集用来建立模型，叫 Training set 训练集，然后另一个数据集测试模型，叫 testing set，测试集。有些文章的样本做外部验证，叫 validation se

18、t 验证集，由此证明模里还有第三份样本或者是型的有效性。除了建立多靶标的统计模型，还可以把有一定相关性的一组进行聚类分析，做数据库，这里就用到 DAVID、KEGG 和 GSEA。所以纯生信套路本质上是利用的高通量结果进行统计分析处理，再来点交互点缀的数据套路，各种分析需要融会贯通。完整来说这套干的研究策略一共包含 4 个技能分支：第一个是系统搜索资料和荟萃分析的方法，如果你学过 META，这个思路是一样的。某一个问题，把所有已有的高通量数据META 在一起，多份数据合并，这时候往往要求入组的数据采用同一个技术平台，或者用统计把它们的表达值标准化，让不同研究项目之间的数据可以进行整合比较。从单

19、研究上升到多研究数据整合，其严谨性能得到提高。第二个技能是把数据的数据做差异做高通量筛选还是分析的，这里面最好是懂点 R 语言，会用一些软件。无论是你用别人的数据，用到的技能是一样的，需要从或者的原始数据转换到差异列表。第三个技能分支是临床相关性的统计分析，主要是单因素，多因素，COX、logistic 回归，Pearson、spearman 相数等等，说起来简单，做起来需要注意很多细节，这些统计临床研究中也频繁要用到，必须要学。最后一个技能分支通路分析工具，跟差异分析差不多，是用一些现成工具，可以出一些炫酷的图。这四种技能都学会了，你就是一个资深生信者，虽然离专业选手还有一个编程语言的距离，

20、你还编写工具，只能是用别人做好的工具来处理想处理的数据，但是不做湿实验，发干文章灌灌水已经毫无问题了。不过你都这么强大了，只是发点灌水文章有点亏吧？后面加上干湿结合，有生物学实验验证，你可以飞得更高。干湿结合是说在你通过生信分析获得一组靶标的时候，不仅局限在临床相关性的统计分析，以选择其中有创新性的一个或多个，进行细胞、动物实验的表型验证。Gain of function，loss of function，证明这些之所以有表达差异，也有临床意义，是因为它具有某种影响疾病、表型的功能。接下来继续探讨机制，下游通路、靶点，找上游驱动因素，甚至直接筛选和验证相互作用的高水平文章。，这样逐步深入发展成

21、一个多元变量的我们换个角度看看文章数据堆砌过程中的要素，会对生信技能在基础研究中的价值有更好的理解。当一个课题满足单变量有表型，数据有细胞也有动物，这就是个毛坯，想文章发- 4 -得更高有 3 个方面的加分项可选：第一，加生信分析，给这个套上一个怎么获得的理由，找数据的样本资料给你的结果做佐证，这可以加分。也就是说干湿结合并不一定就是从干的分析到湿的验证，有些人恰恰是先有了功能，然后反向往上找数据库验证，增加数据的说服力。第二个方面，可以结合临床资料进行分层分析，有生存预后数据可以显著提升项目的临床意义，对文章的价值影响不小，也是医生做科研的一个优势。第三个加分项是在机制上，特别是相互作用上精

22、雕细琢，要知其然知其所以然。想象一下，一篇文章上来会有数据库前人研究的数据挖掘指明一个方向，然后会有样本的一系列验证，还有临床相关性的统计分析结果，提出临床意义，接下来是细胞动物表型和机制的实验结果，做通路或者靶点调控的时候用一些数据库和进行构建，除了间接机制还有直接靶点，也会用到数据库再加上经典实验验证，这样的文章无疑有满汉全席的味道。干湿结合之所以成为一种科研的趋势，是因为它确实给基础研究带来了解构问题的全面角度。分析和实验验证是密不可分的整体，一般来说机制做得强的生信能力并不一定也强，反之生信厉害的人一般做实验能力很弱，背后的是这些技能都需要花时间去，你并没有比别人多出来的时间，所以两种

23、技能都精通的人是稀缺的。文章到了一定档次，常规的套路大家都会，的也有合作伙伴来补位，发顶级期刊还是需要提出具有性的创新观点，我只能指路，师傅领进门，未来修行靠个人。今天是第三章“始制有名”收官的一策，我再带大家梳理一下这一路走来我们学习基础科研的思维递进层次。我们在前三策提出疾、型、模、法、标的恒量套路，把医学科研的特性提 炼出来，这是基础科研的第一层功力。一旦疾病和表型的组合确定，细胞动物模型、检测方法和标志物这些东西就是一套标准动作了。基础科研的第二层功力就要领会变量的作用，我们在 456 三策了、和通路三个常见的变量参数，变量加上恒量最简单的课题设计思路就有了，这是我们的第一章，性提出了

24、科研模块化拆解的。第三层功力，是课题 idea知道了恒量中代入一个变量就一个课题，就像是课题的的关键。这是 7、8从哪里来是这一层的关键技能，我们了一句经典口诀：要么筛，要么猜，讲的，里面有很多经验是经历过的或者是看到过的血的教训。结合今天讲到的第四类样本数据库，你就会明白高等级的筛、猜就是运用好这些生信分析技能，个一年半载，没这个精力在网上是现成的，只是你会挖掘的问题。愿意就找合作伙伴或者是公司来分析，解决了来源的问题 SCI 文章会源源不断。接下来，我们要注意这个变量还有多变的形态，要擅于解除它的，不管你怎么变，我火眼金睛都能识破，这算是第四层功力。我们用 9、10、11、12 四策，具体解构了功能、miRNA、lncRNA 三类的研究套路以及饰的常见模式。到这里第一章恒量+变量的框架变得具体起来，有了详细的操作步骤，如果只是 3 分以下的 paper 灌灌水的话，学到这里就能玩得转了。这当中的一些实验细节，你对照着文献来理解是完全能快速进行实践操作的，大家可以配合套路课强化吸收。入门阶段到第二结束了，第三章开始学习多元变量的体系，前面疾、型、模、法、标不能忘，变量的各种具体变化还要记着，然后变化再乘以变化，一个变量变成二元甚至三元，这就是第五层功力了。就像是练武打