各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看)

1、各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加 3个碱基做保护。寡核苷酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头 上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通

2、常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用y32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A 260单位的寡核苷酸。取1 Q已标记了的寡核苷酸与 20单位的内切酶，在 20° C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液 含 70 mM Tris-HCI （pH 7.6）, 10 mM MgCI 2 , 5 mM DTT 及适量的 NaCl 或 KCI （视酶的具体要求而 定）。20%的PAGE （ 7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低

3、。11酶寡核苷酸序列链长切割率%2 hr20 hrAcc IG GTCGAC C800CG GTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIIcacatgt g800ccacatgt gg10>90>90ccc acatgt ggg12>90>90Asc IGGCGCGCC8>90>90AGGCGCGCC T10>90>90TTGGCGCGCC AA12>90>90nAva ICCCCGGG G850>90CC CCCGGG GG10>90>90TCC CCCGGG GGA12>90&

4、gt;90BamH ICGGATCC G81025CG GGATCC CG10>90>90CGC GGATCC GCG12>90>90、Bgl IICAGATCT G800GAAGATCT TC1075>90GGA AGATCT TCC1225>901BssH IIGGCGCGC C800AG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA1250>90BstE IIG GGT(A/T)ACC C9010BstX IAACTGCAGAA CCAATGCATTGG2200AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA242550CTGCAG

5、AA CCAATGCATTGG ATGCAT2725>90Cla ICATCGAT G800GATCGAT C800CC ATCGAT GG10>90>90CCC ATCGAT GGG125050EcoR IG GAATTC C8>90>90CG GAATTC CG10>90>90CCG GAATTC CGG12>90>90厂Hae IIIGG GGCC CC8>90>90AGC GGCC GCT10>90>90TTGC GGCC GCAA12>90>90Hind IIICAAGCTT G800CC AA

6、GCTT GG1000CCC AAGCTT GGG1210751Kpn IGGGTACC C800GG GGTACC CC10>90>90CGG GGTACC CCG12>90>90Mlu IGACGCGT C800CGACGCGT CG102550iNco ICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075Nde ICCATATG G800CC CATATG GG1000CGC CATATG GCG1200GGGTTT CATATG AAACCC1800GGAATTC CATATG GAATTCC2075>90GGGAATTC CATATG

7、GAATTCCC2275>90Nhe IGGCTAGC C800CG GCTAGC CG101025CTAGCTAGC TAG121050Not ITTGCGGCCGC AA1200ATTT GCGGCCGC TTTA161010AAATAT GCGGCCGC TATAAA201010ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT242590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA2825>90Nsi ITGC ATGCAT GCA1210>90CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT22>90>90Pac ITTAATTAA80

8、0GTTAATTAA C10025CC TTAATTAA GG120>90Pme I800GTTTAAACGGTTTAAAC C10025GG GTTTAAAC CC12050AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG2475>90Pst IGCTGCAG C800TGCA CTGCAG TGCA141010AACTGCAG AACCAATGCATTGG22>90>90AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA24>90>90CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT2600Pvu ICCGATCG G800ATCGATCG

9、AT101025TCG CGATCG CGA12010LSac ICGAGCTC G81010Sac IIGCCGCGG C800TCC CCGCGG GGA1250>90Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075Sca IGAGTACT C81025AAAAGTACT TTT127575rSma ICCCGGG6010CCCCGGG G8010CC CCCGGG GG101050TCC CCCGGG

10、 GGA12>90>90Spe IGACTAGT C810>90GG ACTAGT CC1010>90CGG ACTAGT CCG12050CTAG ACTAGT CTAG14050Sph IGGCATGC C800CAT GCATGC ATG12025ACAT GCATGC ATGT141050Stu IAAGGCCT T8>90>90GA AGGCCT TC10>90>90AAAAGGCCT TTT12>90>90Xba ICTCTAGA G800GC TCTAGA GC10>90>90TGC TCTAGA GCA12

11、75>90CTAG TCTAGA CTAG1475>90Xho ICCTCGAG G800CC CTCGAG GG101025CCG CTCGAG CGG121075Xma ICCCCGGG G800CC CCCGGG GG102575CCC CCCGGG GGG1250>90TCCC CCCGGG GGGA14>90>902. 双酶切的问题参看目录，选择共同的 buffer。其实，双酶切选哪种 buffer是实验的结果，takara 公司从1979 年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果

12、得到的。有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。3. 酶切底物 DNA ，切不开1 ）底物 DNA 上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。2 ）PCR 引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。 PCR 产 物酶切前尽量进行精制以更换 buffer 。由于 PCR 产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道， 通常 PCR 产物的添加量占总反应体积 25% 以下没有问

13、题。3 ）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的 DNA ，同样量，用不同的限制酶切情况 可能不同，由于 DNA 的空间结构造成的。同样的 DNA ，不同的反应体系，酶切效果也可能不同， 由于一些空间因素或不可测因素造成的。4 ）公司出售的限制酶都是液体状态， 都是根据最佳反应体系配制了浓度， 不可以再用 buffer 稀释， 因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会 出现底物 DNA 不能被切断的现象。不同公司的酶和 buffer 不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。5 ）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒 DNA 转入甲基 化酶欠损的宿主菌中，重新制备 DNA ，也可以使用 PCR 的方法对 DNA 进行扩增，再做酶切。 常用 的有 XbaI 容易受甲基化影响，通常选用 GM33 做宿主菌转化。6 ）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化 DNA 。一般做乙醇沉淀纯化即 可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。4. DNA 经酶切后，电泳无带或出现 smea