分子生物学技术考试答题要点

1、深圳大学研究生试题 答案学 院 生命科学学院 专 业 细胞生物学 课程名称 分子、生物学研究方法 拟题人 田生礼 唐玉林 审题人 1. 何谓载体？载体的必备条件有哪些？（9分）携带外源基因进入宿主细胞的工具。体外重组DNA实验中，将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具称为载体(vector)，这也是一个DNA分子。1）克隆载体上要有复制起点，表达载体还需有启动子；2）载体上要有选择标记基因或报道基因；3）除了置换型的载体外，载体上具有多个限制性内切核酸酶的酶切位点，对一种限制酶来说只能有一个。2. 采用末端标记DNA探针是常用的分子生物学技术，请你先解释分子生物学中核酸探针的概

2、念，请你采用至少两种方法来标记DNA探针。（10分）答题要点：核酸探针：是指利用杂交技术检测特异核酸序列必须使用探针。一个探针可以是能检测互补核酸序列的简单的DNA或RNA分子。末端标记DNA探针可以有如下方法1）. 利用T7DNA聚合酶在没有底物时，发挥它的35外切酶活性，随后加入-32p-dGTP，发挥它的聚合酶活性标记3端；2）. 利用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，再用磷酸激酶在底物g-32p-dATP存在的情况下标记DNA5端；3）. 利用DNA末端转移酶在底物-32p-dGTP存在的情况下标记DNA的3端。3. 一个未知序列的真核cDNA片段，3和5端均为平末端，欲把其克隆到一个原

3、核表达载体中，并且可以获得表达。采用哪些克隆策略可以成功克隆该基因（至少两种方法）？如何证明克隆和表达成功？（提示：先克隆测序、再克隆、鉴定、表达、证明表达成功）（12分）答题要点：由于是一个未知序列的基因可以采用先克隆到测序载体的方法：1在载体上涌Smal I切割载体直接插入；2采用同聚物加尾克隆；3加人工接头；4加衔接物。克隆后测序。再根据成熟肽的序列设计引物，利用PCR扩增目的基因，通过酶切后克隆到表达载体；通过酶切鉴定和测序确定克隆成功，通过诱导表达后的SDS-PAGE电泳及western blot或质谱鉴定和证明表达成功。4. 核酸分子杂交技术主要包括Southern Blot 和

4、Northern Blot，简述这两个技术的原理和主要过程（步骤）。为什么Northern Blot检测时还要杂交一个看家基因？（15分）答题要点：这两个技术的基本原理是根据核酸同源序列互补的原理，在变性后核酸分子双链打开，复兴后依据碱基互补配对的原理重新形成双链。这样把其中的一条已知序列的核酸链标记上同位素或地高辛就成为探针，可以检测样品中的未知序列。Southern Blot 是用于检测基因组中是否有同源序列的存在，现将DNA通过限制性内切酶没切，电泳分离，变性转膜，封闭，杂交和检测等步骤；Northern Blot是用于检测基因是有表达，因此要提取总RNA，进行琼脂糖变性胶电泳，转膜，封

5、闭，杂交和检测。Northern Blot通常必须检测看家基因的表达，以它为基准确定目的基因的表达情况，否则将不能说明表达水平的真正变化。5在蛋白定位、蛋白纯化、蛋白相互作用分析等研究中常用的Epitope tags有多种。请尝试利用其中之一、二来设计一方案，利用蛋白沉降(pull down)技术来研究两蛋白A、B间的相互作用，并叙述该实验的原理。（12分）答题要点：获得A、B基因的cDNA；选用Epitope tags如His6 tag，c-MYC tag，GST tag等；将A、B基因分别克隆到含His6 tag，c-MYC tag的大肠杆菌表达上；提取蛋白，用对应的可纯化这两蛋白的纯化柱

6、（镍柱，sepharose-protein G-c-MYC抗体柱）纯化蛋白；相互作用分析：将蛋白A、B在缓冲液中混合、作用；再与镍柱或sepharose-protein G-c-MYC抗体柱结合，分析蛋白被沉降的可能性。注意设计对照（柱A，柱B，柱(A+B）；通过结合平衡清洗洗脱的环节，分别收集各环节的流出液，进行蛋白电泳和western分析。6为了研究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶p107的作用方式和机制，以蓖麻子种子为材料，通过利用CO-IP技术，获得了多个与p107蛋白相互作用的putative蛋白，其中之一是BTPC蛋白。为进一步分析p107与BTPC间的相互作用，研究人员再次对这两蛋白进行了C

7、O-IP分析验证，结果如下图。请分析图中结果能说明的问题，这两个蛋白间真的存在很强的相互作用吗？你觉得，为了更清楚的得到正确结论，是否有必要同时对提取的总蛋白和洗脱之前的平衡清洗流出液进行分析？（12分）Figure. Co-IP of p107 with interactor BTPC in developing castor oil seed. Clarified extracts from 8 g of endosperm tissue of developing castor oil seed were precleared through the pre-immune serum c

8、olumn prior to their elution through the anti-p107-IgG immuno-affinity column. Bound proteins were sequentially eluted with 25% gentle elution buffer (GEB, 温和的洗脱液，pH 7.4), followed by 100 mM Gly-HCl (Glycine, 强洗脱液，pH 2.8). Concentrated eluates were analyzed by 10% SDS-PAGE (A; 5 mg protein per lane)

9、, and immunoblotting using anti-p107-IgG (B; 50 ng protein per lane) or anti-BTPC -IgG (C; 500 ng protein per lane).答题要点：A、SDS-PAGE之后考马司亮蓝染色，显示温和的洗脱和强洗脱流出液中蛋白存在的情况；B、C是蛋白电泳后wester-blot的结果，B：温和的洗脱和强洗脱流出液中蛋白用抗p107的抗体检测的结果，显示p107存在于强洗脱流出液中，即表明p107被anti-p107-IgG immuno-affinity column有效结合；B：温和的洗脱和强洗脱流出液

10、中蛋白用抗BTPC的抗体检测的结果，显示BTPC在温和洗脱的情况下即被洗脱。说明BTPC与 p107的结合不牢固。为了更清楚的得到正确结论，有必要同时对提取的总蛋白和洗脱之前的平衡清洗流出液进行分析。7下图是研究转录因子GTL1与PHYA启动子相互作用的结果。分析图B、C，指出各结果说明的问题。（12分）Figure. Transcription factor GTL1 binds to PHYApromoters.(A) Schematic diagram of the GTL1 protein, showing the four helical, N- and C-terminal DNA

11、 binding domains (represented as gray cylinders). Two protein fragments (Nt1 and GTL1N) were fused with MBP.(B) Nt1 and GTL1N polypeptides and a biotin-labeled rice PHYA promoter fragment (400 ng) were used for EMSA. In (B), free probe and GTL1N-probe complexes are indicated by an asterisk and arrow

12、s, respectively.(C) Unlabeled PHYA promoter (2 mg) was used as a competitor to determine the specificity of DNA binding activity for GTL1N.答题要点：A . GTL1结构示意图B. GTL1N可与生物素标记的PHYA启动子结合形成GTL1N-PHYA启动子探针 复合物，使探针在非变性电泳过程中泳动速度变慢，而Nt1不能使探针在非变性电泳过程中泳动速度变慢，即不能与PHYA启动子结合；C. GTL1N可与生物素标记的PHYA启动子结合形成GTL1N-PHYA启

13、动子探针 复合物，使探针在非变性电泳过程中泳动速度变慢，而在加入非标记的GTL1N-PHYA启动子时，可竞争与GTL1N结合，说明GTL1N-PHYA启动子间的结合具有专一性。结果表明GTL1N结合在PHYA启动子上主要是通过N-端的第3、4个DNA结合结构域。8以下三幅图分别是研究蛋白激酶A的活性与actin结合蛋白cofilin之间关系的结果图。根据这三个结果写一个摘要。（提示：FSK（forskolin）毛喉素：它是一种腺苷酸环化酶特异性激活剂，FSK上调细胞内cAMP水平，活化PKA信号途径；cofilin：是一种actin结合蛋白，控制actin的聚合和解聚；Pcofilin是磷酸化

14、的cofilin；PKI：蛋白酶抑制剂；WT：wild type； MEFs：Mouse embryonic fibroblast）（18分）Figure. Activation of PKA cause enhanced pcofilin levels and morphological changes. (A) immunoblot analysis of pcofilin and cofilin levels in Wt(+/+) and knockout(-/-) MEFs treated with forskolin(20 M) or PKI(5 M) for 24h. (B) morphological and growth changes induced in high-density WT MEFs treated with forskolin for 24h. (C) Time-course analysis of pcofilin levels in hele cells treated with 20 M or 40 M答案要点：目的：为研究FSK通过Pcofilin的变化对MEBs细胞形态变化的影响，研究了Pcofilin的变化和MEBs细胞形态变化。方法：利用MEFs细胞、Hela细胞、免疫杂交技术（westernblot）和显微