生物化学实验课件-生命科学与工程

1、生物化学实验课件-生命科学与工程实验目的实验目的 掌握冷冻离心机的操作使用方法。掌握冷冻离心机的操作使用方法。 掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。 掌握分光光度计的使用方法和原理。掌握分光光度计的使用方法和原理。 掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。过程。实验包括三个部分内容：实验包括三个部分内容：一、不同植物样品可溶性蛋白的提取。一、不同植物样品可溶性蛋白的提取。二、植物可溶性蛋白含量的测定。二、植物可溶性蛋白含量的测定。三、聚

2、丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。一、一、不同植物样品可溶性蛋白的提取不同植物样品可溶性蛋白的提取 原理原理 植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶于水主要植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细胞器基质中的存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜可溶性蛋白，另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。将植物材料在一定的提取缓冲液和上的膜结合蛋白。将植物材料在一定的提取缓冲液和04低温下充分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲低温下充分研磨，可溶性蛋白将溶解

3、在提取缓冲液里，通过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到液里，通过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。离心机基本原理离心机基本原理离心力（离心力（centrifugal force，Fc）离心作用是根）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离）的大小等于离心加速度心加速度2X与颗粒质量与颗粒质量m的乘积，即：的乘积，即： FCm 2X其中其中是旋转角速度，以弧度是旋转角速度，以弧度/

4、秒为单位；秒为单位；X是颗粒是颗粒离开旋转中心的距离，以离开旋转中心的距离，以cm为单位；为单位；m是质量，以克为是质量，以克为单位。单位。相对离心力（相对离心力（relative centrifugal force，RCF）由于各种离心机）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用受变化，因此在文献中常用“相对离心力相对离心力”或或“数字数字g”表表示离心力，只要示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。得相同的结果。RCF就

5、是实际离心场转化为重力加速度的倍数。就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。RCFF离心力离心力/F重力重力 m 2X/mg=1.118105 . N . XN（rpm）=RCF105 /（1.18X）式中式中X为离心转子的半径距离，以为离心转子的半径距离，以cm为单位；为单位；g为地球重力加速度为地球重力加速度（980cm/sec2）；）；N为转子每分钟的转数（为转子每分钟的转数（rpm）。）。 植物细胞破碎后通过差数离心形成的沉淀植物细胞破碎后通过差数离心形成的沉淀沉淀沉淀转速转速时间时间内含物内含物A150g20min完整细胞完整细胞B1000g20min细胞核，细胞碎片细胞核，细胞碎片C

6、3000g6min叶绿体叶绿体D10000g20min线粒体、溶酶体、微体线粒体、溶酶体、微体E100500g20min微粒体微粒体F100500g20min0.26%脱氧胆酸脱氧胆酸核糖体核糖体实验注意事项：实验注意事项： 整个操作过程在整个操作过程在04低温下进行；低温下进行； 研磨必须充分；研磨必须充分； 加蛋白酶抑止剂（加蛋白酶抑止剂（PMSF 苯甲基磺酸氟）苯甲基磺酸氟）或抗氧化或抗氧化剂；剂； 提取的蛋白一般需要分装后，在液氮或提取的蛋白一般需要分装后，在液氮或80低温下保低温下保存。存。实验材料、试剂与仪器设备实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料（一）实验材料自选植物材料，至少

7、三种以上处理，例如：自选植物材料，至少三种以上处理，例如：1、不同植物的叶片；、不同植物的叶片；2、同一植物的根、茎、叶、花等不同组织器官；、同一植物的根、茎、叶、花等不同组织器官；3、同一植物不同发育状态如嫩叶、成熟叶和老叶；、同一植物不同发育状态如嫩叶、成熟叶和老叶；4、或者叶片用不同的高温处理等等。、或者叶片用不同的高温处理等等。（二）试剂（二）试剂 1提取缓冲液：提取缓冲液：0.125 mol 的的Tris-HCl, pH7.0，称取称取12.5gTris于烧杯，用适量双蒸水溶解，于烧杯，用适量双蒸水溶解，HCl调调pH至至7.0,定容至定容至1000ml。 2聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡

8、咯烷酮（PVP） 3-巯基乙醇巯基乙醇（三）设备（三）设备 冷冻离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，冷冻离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等试管等 准确称取准确称取0.5g植物材料，加入植物材料，加入2ml预冷的提取预冷的提取缓冲液，缓冲液，0.1g聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮PVP和和50l的的-巯基乙醇，置冰浴研磨匀浆后巯基乙醇，置冰浴研磨匀浆后,转移到转移到10ml塑料塑料离心管，用离心管，用3ml提取液分两次洗涤研钵，提取液提取液分两次洗涤研钵，提取液总体积总体积5ml，10000g下离心下离心10min，上清液为可，上清液为可溶性蛋白的粗提液。溶性蛋白的粗提液。 操作步骤操作步骤二

9、、植物可溶性蛋白含量的测定二、植物可溶性蛋白含量的测定 原理原理 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G-250 （ Coomassie brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白质法是利用蛋白质 -染料结合的原理，定量地测定微量蛋白染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。质浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料浓度范围内，蛋白质和染料结合符合

10、比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由光吸收由 465 nm 变成变成 595 nm ，通过测定，通过测定 595 nm 处处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h ，之后，蛋白质之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比此法灵敏度高（比 Lowry 法灵敏法灵

11、敏 4 倍），易于倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 试剂与仪器设备试剂与仪器设备 冷冻离心机，研钵，烧杯，离心管，冷冻离心机，研钵，烧杯，离心管，（二）试剂（二）试剂 1. 标准蛋白质溶液（标准蛋白质溶液（ 100 g mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白白 25 mg ，加水溶解并定容至，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液，吸取上述溶液 40

12、 mL ，用蒸馏水稀释至用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。即可。 2. 考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G-250 ，溶于，溶于 50 mL 90 乙醇中，加入乙醇中，加入 100 mL 85 （ W V ）的磷酸，再用）的磷酸，再用蒸馏水定容到蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。 （三）仪器设备（三）仪器设备 分光光度计，烧杯，量瓶，移液管，试管等。分光光度计，烧杯，量瓶，移液管，试管等。 操作步骤操作步骤试试 剂剂管管 号号1 23456标准蛋白质标准蛋白质（ mL ）0 0.

13、200.400.600.801.00蒸馏水量蒸馏水量（ mL ）1.00 0.800.600.400.200蛋白质含量蛋白质含量（ g ）0 204060801001.标准曲线的绘制标准曲线的绘制 取取 6 支试管，按下表支试管，按下表 加入试剂，摇匀，向各管中加入加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以左右，以 0 号试管为空白号试管为空白对照，在对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2.

14、 样品测定样品测定 吸取先前提取的可溶性蛋白提取液吸取先前提取的可溶性蛋白提取液 0.1 mL （视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复样品重复 23 次），加入次），加入0.9ml蒸馏水，加入蒸馏水，加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置 2 min 后在后在 595 nm 下比色，测定吸光度，并通过标准曲下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。线查得蛋白质含量。 结果计算结果计算样品中的蛋白质含量（样品中的蛋白质含量（CVT）/(VSWF1000) （ mg/g ） 式中：式中： C 查标准曲线值，

15、查标准曲线值， g 。 VT 提取液总体积提取液总体积 , mL 。 VS 测定时加样量测定时加样量 , mL 。 WF 样品鲜重样品鲜重 , g 。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离植物可溶性蛋白植物可溶性蛋白 电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。术。电泳基本原理：电泳基本原理： 电泳现象早在电泳现象早在1808年就已经被发现年就已经被发现,但电泳作为一种分离但电泳作为一种分离技术却是

16、在技术却是在1937年由瑞典科学家年由瑞典科学家Tiselius A首先提出来的首先提出来的,并并设计出世界上第一台自由电泳仪设计出世界上第一台自由电泳仪,建立了建立了移界电泳移界电泳分离模分离模式式.他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动动,首先证明了血清是由白蛋白首先证明了血清是由白蛋白,1,2,和和球蛋白组成的球蛋白组成的,为为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献表彰他对电泳技术所做出的突出贡献,1948年他被授予诺年他被授予诺贝尔奖贝尔奖. COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- +

17、 OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PH纤维状纤维状（2）电场强度：）电场强度：E越大，越大，V越大越大（3）缓冲液）缓冲液pH：pH 决定决定Q，(pH-PI)越大，越大，Q越多，越多，V越大；成分：性质稳定，不易电解。越大；成分：性质稳定，不易电解。（4）缓冲液离子强度：最合适的离子）缓冲液离子强度：最合适的离子强度应该在之间。缓冲液离子强度越强度应该在之间。缓冲液离子强度越大，样品电流减小，大，样品电流减小，V变小；缓冲液离变小；缓冲液离子强度越小，样品电流越大，子强度越小，样品电流越大，V越大，越大，但样品易扩散。但样品易扩散。（5）电渗现象：液体对固体的相对）电

18、渗现象：液体对固体的相对移动，由缓冲液的水分子和支持介移动，由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电质的表面之间所产生的一种相关电荷所引起。电渗与电泳方向相同，荷所引起。电渗与电泳方向相同，V变大；反之变小。变大；反之变小。（6）支持介质：惰性材料，有一定坚韧度，）支持介质：惰性材料，有一定坚韧度，可以保存；吸附力要小；无电渗作用可以保存；吸附力要小；无电渗作用 （7）温度：过高，由于产热增加、水分蒸发，）温度：过高，由于产热增加、水分蒸发，对电泳不利。对电泳不利。电泳的分类电泳的分类一、按分离的原理分类一、按分离的原理分类1、区带电泳、区带电泳 不同的组分在均一的缓冲液系统中分

19、离成独立的区带，可以用染色等不同的组分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。电泳的方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大可减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。大提高，是应用最广泛的电泳技术。 2、移界电泳、移界电泳 把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上把电场加在生物大

20、分子溶液和缓冲溶液之间的界面上,带电颗粒的移带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动。它只能起到部分分离的作动速度通过光学方法观察界面的移动。它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得到一个个台阶状的图形，最前面用，如将浓度对距离作图，则得到一个个台阶状的图形，最前面的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。其是的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。其是Tiselius最早建立的最早建立的电泳方法。电泳方法。 3、等速电泳、等速电泳 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按距离对浓度作图也是台阶状，但不同于以等速移动。按距离

21、对浓度作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。 4、等电聚焦电泳、等电聚焦电泳 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成中自动形成PH梯度，被分离物则各自移动到其等电梯度，被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率高。点而聚成很窄的区带，分辨率高。 二、按有无固体支持物分类二、按有无固体支持物分类1、自由电泳、自由电泳 显微电泳显微电泳 移界电泳移界电泳 柱电泳柱电泳 自由流动幕电泳自由流动幕电泳 等速电泳等速电泳2、支持物电泳、支持物电泳（1）无阻滞的支

22、持物）无阻滞的支持物 纸电泳纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳 薄层电泳薄层电泳（2）凝胶电泳）凝胶电泳 淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1.1.连续电泳：缓冲液的离子成分、连续电泳：缓冲液的离子成分、PHPH、凝胶浓度、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。效应、分子筛效应。2.2.不连续电泳：缓冲液离子成分、不连续电泳：缓冲液离子成分、pHpH、凝胶浓度、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷

23、效应、分子筛效应。电荷效应、分子筛效应。三、根据电泳的过程的连续性分为三、根据电泳的过程的连续性分为分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。力大，移动慢。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。浓缩效应：样品在电泳的过程中被浓缩成高浓度的薄层。浓缩效应：样品在电泳的过程中被

24、浓缩成高浓度的薄层。四、根据电压的高低分四、根据电压的高低分 常压电泳（常压电泳（100500V） 高压电泳（高压电泳（500V以上）以上）五、根据电泳槽的形状分五、根据电泳槽的形状分 垂直电泳垂直电泳 水平电泳水平电泳 柱状（圆盘）电泳柱状（圆盘）电泳 毛细管电泳毛细管电泳原理：原理：以醋酸纤维薄膜为支持物，在以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6pH=8.6的巴比妥缓的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的冲液中，血清蛋白的PIPI均小于均小于8.68.6，带负电荷，电泳时，带负电荷，电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离。向正极移动。由于迁移率不同而被分离。一、醋酸纤维薄膜电泳一、醋酸纤维薄膜电泳

25、（cellulose acetate membrane electrophoresis）醋酸纤维薄膜是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔醋酸纤维薄膜是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中，如血清膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中，如血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。它具有简单快速等优点，电渗作用虽然较高但很均及同工酶等。它具有简单快速等优点，电渗作用虽然较高但很均一一 ，不影响样品的分离效果。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺，不影

26、响样品的分离效果。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，由于薄膜厚度小（约凝胶电泳低，由于薄膜厚度小（约10100m），样品用量），样品用量很少，不适于制备。很少，不适于制备。结果示意图：结果示意图： 2 1清蛋白清蛋白（一）（一）实验原理：实验原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称，简称Acr)和交联剂和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称，简称Bis)在在加速剂加速剂N，N，N ，N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N，N，N ，N tetramethyl ethylened

27、ia mine，简称，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称，简称AP)或核黄素或核黄素(ribofavin即即vitamin B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称，简称PAGE)。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）Acr和和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、

28、粘度、弹性、机械的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。强度以及孔径大小。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为凝胶浓度，用为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的表示。凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的百分数称之为交联度，用百分数称之为交联度，用C%表示。表示。 T%（a+b）100/m C%b100/(a+b)式中式中 aAcr的质量（的质量（g）；）；bBis的质量（的质量（g）；）；m凝胶溶液总体积（凝胶溶液总体积（ml）。）。在此，在此，a b（W/W）是关键；）是关键；a b 10时，形成的

29、凝胶脆、硬、时，形成的凝胶脆、硬、呈乳白色；呈乳白色；a b100时，即使时，即使5%的凝胶也呈糊状，易断裂。要制备的凝胶也呈糊状，易断裂。要制备透明而有弹性的凝胶，透明而有弹性的凝胶，a b要控制在要控制在30左右。通常左右。通常T = 2%5%时，时，a b =20左右；左右；T = 5%10%时，时，a b =40左右；左右；T = 15%20%时，时，a b =125200左右。左右。T在在3%25%的范围内，凝胶易发生聚合。的范围内，凝胶易发生聚合。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；在一定浓度时，凝胶透明，有

30、弹性，机械性能好；(2)(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)(3)对对pHpH和温度变化较稳定；和温度变化较稳定；(4)(4)几乎无吸附和电渗作用，只要几乎无吸附和电渗作用，只要AcrAcr纯度高，操作条件一致，则样品纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；分离重复性好；(5)(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达1010-6-6g g(6)(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的

31、浓度调节凝胶的孔径；浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。的选择与被分离物质分子量密切相关。 下表是分子量范围与凝胶浓度的关系下表是分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围分子量范围 适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度/(%) 蛋蛋 白白 质质 104 20-30 1-4104 15-20 1

32、-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。两大类。 目前常用的多为圆盘电泳目前常用的多为圆盘电泳( (如图如图1)1)和板状电泳和板状电泳( (如如图图2)2)，两者电泳原理完全相同。，两者电泳原理完全相同。图图1 1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A(A为正面为正面,B,B为剖面为剖面) )(1)(1)样品胶样品胶pH6.7 (2)pH6.7 (2)浓缩

33、胶浓缩胶pH6.7 pH6.7 (3)(3)分离胶分离胶pH8.9 (4)pH8.9 (4)电极缓冲液电极缓冲液pH8.3pH8.3圆盘电泳槽图图2 2 夹心垂直板电泳槽示意图夹心垂直板电泳槽示意图 图图3 3 凝胶模示意图凝胶模示意图1.1.样品槽模板样品槽模板 2.2.长玻璃板长玻璃板 1.1.导线接头导线接头 2.2.下贮槽下贮槽 3.3.凹形橡胶凹形橡胶框框 4.4.样品槽模板样品槽模板 5.5.固定螺丝固定螺丝 6.6.上贮槽上贮槽 7.7.冷凝系统冷凝系统 美国美国BioRad公司的小型垂直电泳槽公司的小型垂直电泳槽 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。不连续体系由电极缓

34、冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由浓缩胶是由APAP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7pH6.7的的Tris-HC1Tris-HC1。分离胶是由。分离胶是由APAP催化聚合而成的小孔催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是。电极缓冲液是pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。甘氨酸缓冲液。2 2种孔径的凝胶、种孔径的凝胶、2 2种缓种缓冲体系、冲体系、3 3种种pHpH值使不连续体系形成了凝胶孔径、值使不连续体系形成了凝胶孔径、pHpH值、值、缓冲液

35、离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。因素。浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应三大效应：三大效应：成分成分pH值值孔径孔径电泳缓冲液电泳缓冲液甘氨酸甘氨酸(慢离子慢离子)8.3样品样品蛋白质蛋白质6.7浓缩胶浓缩胶Cl-(快离子快离子)6.7大大分离胶分离胶Cl-(快离子快离子)8.9小小有效迁移率有效迁移率 = 迁移率迁移率 解离度解离度（1 1）缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、PHPH的不连续性：电极缓冲液的的不连续性：电极缓冲液的pH=8.3pH=8.3，甘氨酸，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子

36、完全电离，有效的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。（2 2）凝胶孔径的不连续性：凝胶孔径的不连续性：在电场

37、作用下，蛋白质颗粒在大孔胶在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。处，因迁移受阻而被压缩。浓缩效应浓缩效应单体：丙烯酰胺（单体：丙烯酰胺（AcrAcr）；）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（交联剂：甲叉双丙烯酰胺（BisBis）；）；催化剂：过硫酸胺或核黄素；催化剂：过硫酸胺或核黄素；加速剂：四甲基乙二胺（加速剂：四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）；）；产物：三维网状结构凝胶。产物：三维网状结构凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, P

38、AG）的聚）的聚合反应：合反应：操作步骤：操作步骤：1.1.制备制备PAGEPAGE胶柱胶柱封口封口灌分离胶，封水灌分离胶，封水灌浓缩胶，封水灌浓缩胶，封水2.2.上样，电泳上样，电泳3 3. . 染色，观察结果染色，观察结果1 1过硫酸铵和四甲基乙二胺（过硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）比例随温度）比例随温度改变进行调整。改变进行调整。2 2制胶时，要充分摇匀，及时灌胶，及时冲洗玻制胶时，要充分摇匀，及时灌胶，及时冲洗玻璃滴管。璃滴管。3 3加注水层必须缓慢细流，量适中。加注水层必须缓慢细流，量适中。4 4AcrAcr和和BisBis有毒。有毒。5 5注意观察实验现象：分界面，浓

39、缩效应注意观察实验现象：分界面，浓缩效应6 6固体胶切忌倒入水池。固体胶切忌倒入水池。注意事项：注意事项：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,(sodium dodecyl sulfate,简称简称SDS)SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率

40、主要取决于，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用可以利用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。97.4 KD66.2 KD45 KD31 KD21.5 KD14.4 KDM 25 35 40 45 50 55 60 SDS-PAGE电泳分离光合膜蛋白电泳分离光合膜蛋白聚丙烯酰胺圆盘绿胶电泳分离聚丙烯酰胺圆盘绿胶电泳分离光合膜上的超分子复合体光合膜上的超分子复合体25 35 40 45 50 Mark 25 35 40 45 50 97.4 KD66.2 KD45 KD31 KD2

41、1.5 KD14.4 KDSDS-PAGE电泳鉴定超分子复合体电泳鉴定超分子复合体三、琼脂糖凝胶电泳三、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是由由D型和型和L型半乳糖以型半乳糖以-1，3和和-1，4糖苷键相糖苷键相连形成的线状高聚物（如下图所示）。琼脂糖连形成的线状高聚物（如下图所示）。琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔径范围从径范围从50nm到大于到大于200nm的凝胶。的凝胶。琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化核酸的常用技术。核琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化核酸的常用技术。核酸

42、是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低

43、浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定核酸在凝胶中）进行染色，可直接在紫外灯下确定核酸在凝胶中的位置。的位置。 影响核酸琼脂糖凝胶电泳的几个因素：影响核酸琼脂糖凝胶电泳的几个因素： 1. 核酸分子的大小：线性核酸分子的迁移率核酸分子的大小：线性核酸分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。与其分子量的对数值成反比。 2. 琼脂糖浓度：一定大小的核酸片段在不同浓琼脂糖浓度：一定大小的核酸片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的核酸在一定

44、浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的核酸片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的核酸，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。同大小的核酸，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度可分辨的线性核酸片可分辨的线性核酸片段大小（段大小（kb）0.40.45-605-600.70.70.8-100.8-101.01.00.4-60.4-61.51.50.2-40.2-41.751.750.2-30.2-32.02.00.1-30.1-3 3. 核酸分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶核酸分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋中，超螺旋DNA分子迁移率

45、比线性分子迁移率比线性DNA分子快，分子快，线性线性DNA分子比开环分子比开环DNA分子快。分子快。 4. 电流强度：每厘米凝胶电压不超过电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性核酸分子的电泳迁移率与所用电压成正比。性核酸分子的电泳迁移率与所用电压成正比。DNA片段的琼脂糖凝胶电泳 操作步骤：操作步骤： 1. 将凝胶成形模具两端用医用胶布封好，水平放置，将选将凝胶成形模具两端用医用胶布封好，水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间。空间。 2. 称取称取DNA

46、电泳用琼脂糖电泳用琼脂糖0.8g放入放入250ml的三角烧瓶中，的三角烧瓶中，加入加入100ml 1TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。炉上，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。 3. 关闭电炉，取下三角烧瓶，将其置室温下冷却至关闭电炉，取下三角烧瓶，将其置室温下冷却至70左右左右(手握烧瓶可以耐受手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭，再加入溴化乙锭(10mg/ml)5l，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液本实验所用制胶板约需胶液100ml。 4. 室温下待凝胶完全凝固，需时约室温

47、下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，揭分钟，揭去二端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。去二端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。 5. 在电泳槽加入在电泳槽加入1TAE缓冲液，以高出凝胶表缓冲液，以高出凝胶表面面2mm为宜为宜 6. 用加样器吸取样品。依序分别加入点样孔用加样器吸取样品。依序分别加入点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。外。 7. 接通电源，调节电压至接通电源，调节电压至50伏，电泳伏，电泳90分钟后，分钟后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。将凝胶板取出

48、，在紫外灯下观察结果。试剂与材料：试剂与材料：1. 琼脂糖琼脂糖2. 6点样缓冲液：点样缓冲液：0.25%溴酚兰、溴酚兰、40%蔗糖蔗糖3. DNA分子量标准：分子量标准：DNA分子量标准：分子量标准：DNA/Hind4. 50TAE电泳缓冲液贮存液配方：电泳缓冲液贮存液配方：(50)每升每升242g Tris57.1ml 冰醋酸冰醋酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)1缓冲液浓度：缓冲液浓度：0.04mol/L Tris HAc、0.002mol/L EDTA5. 0.8%琼脂糖：琼脂糖：0.8g琼脂糖用琼脂糖用100ml 1TAE沸水浴溶解沸水浴溶解6. 10mg/ml

49、EB 1.0g 溴乙锭溴乙锭100ml 三蒸水三蒸水凝胶成像系统凝胶成像系统电泳的染色电泳的染色一、蛋白质染色一、蛋白质染色1、氨基黑、氨基黑10B染色法染色法2、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝R250染色法染色法3、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝G250染色法染色法4、固绿染色法、固绿染色法6、银染染色法、银染染色法7、广谱染料染色法、广谱染料染色法二、核酸的染色二、核酸的染色1、RNA染色法染色法 焦宁焦宁Y染色法染色法 甲苯胺蓝甲苯胺蓝O染色法染色法 次甲基蓝染色法次甲基蓝染色法 荧光染料溴化乙锭（荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色法染色法2、DNA的染色的染色 EB染色法染

50、色法 甲基绿染色法甲基绿染色法 二苯胺染色法二苯胺染色法 Feulgen染色法染色法器材器材电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和相配套电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和相配套的凹槽玻璃）；真空泵及真空干燥器；台式的凹槽玻璃）；真空泵及真空干燥器；台式高速离心机（高速离心机（10000rpm）；烧杯：）；烧杯：50ml1、25ml1；三角瓶：；三角瓶：100ml1；微量进样器：；微量进样器：50l2；注射器：；注射器：5ml1；穿刺针头；胶头滴；穿刺针头；胶头滴管；刻度吸：管；刻度吸：10ml3、5ml2、0.1ml1；医用胶布；培养皿：医用胶布；培养皿：20ml2（或用白瓷盘代（或用白瓷盘代替，

51、染色用）。替，染色用）。 试剂130%丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr，）；配制后需过滤，）；配制后需过滤21%甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)；310%的过硫酸铵（的过硫酸铵（AP冰箱贮藏，不得超过冰箱贮藏，不得超过5天）；天）；4N，N，N，N -甲基乙二胺（甲基乙二胺（TEMED）；）；5. 10%十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠SDS, 称取称取1g SDS, 定容至定容至10ml；6分离胶缓冲贮备液（分离胶缓冲贮备液（0.375 mol/L Tris-HCl pH8.8）：称取）：称取4.543 gTris, HCl调调pH至至8.8，定容至，定容至100ml；7浓缩胶缓冲贮备液（浓缩胶

52、缓冲贮备液（0.125mol/L Tris-HCl pH6.8）：称取）：称取0.6057g Tris, HCl调调pH=6.8，定容至，定容至40ml；8电极缓冲液（电极缓冲液（0.25mol/LTris，1.92mol/L甘氨酸，甘氨酸，1SDS，pH8.3）：称取）：称取30.23g Tris,144.134g甘氨酸，甘氨酸，10g SDS，重蒸馏水定容至，重蒸馏水定容至1000ml，用时稀释，用时稀释10倍。倍。9样品增溶缓冲液：样品增溶缓冲液：Tris 0.1514g，SDS 0.4g，-巯基乙醇巯基乙醇1ml，甘油，甘油2ml，溴酚，溴酚蓝蓝0.1g，加水稀释到，加水稀释到10ml

53、。10固定液：乙醇固定液：乙醇500ml，醋酸，醋酸100ml，水，水400ml。11染色液：染色液：R250 0.29g，于，于250ml脱色液中。脱色液中。12脱色液：乙醇脱色液：乙醇250ml，醋酸，醋酸80ml，加水至，加水至1000ml。 实验步骤实验步骤 1.凝胶制备：凝胶制备： （1）取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用去污剂洗）取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用去污剂洗净，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻板内面要避免手指触净，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻板内面要避免手指触摸以防沾污。根据所需凝胶厚度选择摸以防沾污。根据所需凝胶厚度选择0.75-3mm厚的玻璃或厚的玻璃或Tef

54、lon夹条，安装并用胶布将两侧封好。将板用铁夹固定于制胶架上，夹条，安装并用胶布将两侧封好。将板用铁夹固定于制胶架上，下部插入封胶琼脂小盒中。待模具安装好后，用电极缓冲液配制下部插入封胶琼脂小盒中。待模具安装好后，用电极缓冲液配制1.5%琼脂液（冬天琼脂液（冬天1.5%，夏天，夏天2%），沸水浴加热至琼脂完全），沸水浴加热至琼脂完全溶化后，用皮头滴管先沿板上部灌入两侧的封胶孔，再直接于溶化后，用皮头滴管先沿板上部灌入两侧的封胶孔，再直接于琼脂盒将琼脂灌入，注意不要产生气泡。一旦用琼脂封板后，琼脂盒将琼脂灌入，注意不要产生气泡。一旦用琼脂封板后，模具不应再挪动，以防产生裂缝。封好的模具应三面有连

55、续琼模具不应再挪动，以防产生裂缝。封好的模具应三面有连续琼脂封闭区。脂封闭区。 丙烯酰胺凝胶配制表丙烯酰胺凝胶配制表 （分离胶（分离胶30ml，浓缩胶，浓缩胶10ml，可根据需要，按比例增减各成份的体，可根据需要，按比例增减各成份的体积。）积。） 类别类别分离胶分离胶浓缩浓缩胶胶T%T%5 57.57.5101012.12.5 5151517.517.520203 330%Acr30%Acr5.05.07.37.39.759.7512.12.3 32 214.8814.8817.417.420.020.01 11%Bis1%Bis4 45.65.67.57.55.45.43.53.53.53.

56、53 31 1分离胶缓冲液分离胶缓冲液3.753.753.753.753.753.753.73.75 53.753.753.753.753.753.75- -浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液- - - - - - - -2.52.5重蒸水重蒸水17.0517.0513.1513.158.88.88.38.33 37.677.675.155.153.053.055.435.4310%AP10%AP0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.070.07（2）根据需要从表中选择适当浓度值，配制凝胶。一般同工酶可选择）根据需要从表中选择适当浓度值，配制凝胶。一般同工酶可选择7.5%10%的胶（过氧化物酶和酯酶的胶（过氧化物酶和酯酶7.5%较合适，超氧化物岐较合适，超氧化物岐化