Toll样受体4对脑缺血再灌注小鼠皮质TRIF表达的影响

1、Toll样受体4对脑缺血再灌注小鼠皮质TRIF表达的影响【摘要】 目的 探讨Toll样受体4（TLR4）对脑缺血再灌注小鼠皮质TRIF表达的影响。方法 小鼠随机分为3组，分别为假手术组和缺血再灌注组、TLR4阻断组，各组又分1、2、3、4 d 4个时间点组。采用TLR4抗体封闭阻断TLR4，Western印迹检测皮质TLR4蛋白、干扰素(IFN)蛋白表达量，免疫组化方法检测TRIF表达变化。结果 缺血再灌注组TLR4蛋白、IFN和TRIF表达水平明显高于假手术组表达水平（P<0.05），而TLR4阻断组TLR4蛋白、IFN和TRIF表达水平明显少于缺血再灌注组（P<

2、0.05）。结论 缺血再灌注可激活TLR4，并引起TRIF和IFN表达量增加，而采用TLR4抗体封闭阻断TLR4后，TRIF和IFN表达量减少，提示TLR4通过上调TRIF表达参与脑缺血再灌注的反应机制。 【关键词】 脑缺血再灌注；TLR4；TLR4阻断；TRIF；IFN 【Abstract】 Objective To study the effect of Tolllike receptor 4（TLR4）on the expression of TRIF during the inflammatory reaction induced by cerebral ischemia reperf

3、usion in mice. Methods After blockade of TLR4 by TLR4 antibody，the expression of TLR4 and interferon (IFN) at the protein level in cortex was examined by Western blot respectively. The expression of TRIF was measured by immunohistochemistry stain. Mice were randomly divided into sham group, ischemia

4、 reperfusion group and TLR4 blocking group in different time points （1, 2, 3 d and 4 d）. Results In the right cortex, TLR4 protein, IFN and TRIF expression of ischemia reperfusion group was distinctly higher than that of sham and TLR4 blocking group（P<0.05）. Conclusions TLR4 participates in c

5、erebral ischemia reperfusion by upregulating the expression of TRIF. 【Key words】 Cerebral ischemia reperfusion; TLR4; TLR4blocked; TRIF; IFNToll样受体4(TLR4）信号通路包括髓样分化因子88(MyD88) 依赖性 (MyD88途径) 和MyD88 非依赖性（TRIF依赖性）两个途径1，2。TRIF为TLR4MyD88 非依赖性信号转导途径中的主要接头蛋白。目前，对TLR4介导的TRIF依赖信号通路的研究主要集中在抗感染免疫反应中3，4，在脑缺血再灌注

6、过程中该信号途径是否发挥作用还没有相关报道。本研究通过观察脑缺血再灌注损伤是否激活TLR4及采用TLR4抗体阻断TLR4后，其胞内衔接蛋白TRIF的表达，探讨TLR4参与脑缺血再灌注的反应机制。1 材料与方法1.1 主要试剂兔抗TLR4单克隆抗体（sc16240）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗、actin抗体、山羊抗IFN单克隆抗体IgG（sc17569）（美国Santa Cruz 公司）；兔抗TRIF单克隆抗体IgG（1866115184）（美国Geneway公司）；免疫组化染色试剂盒（SP9001）（北京中山公司）。1.2 实验动物的分组健康昆明种小鼠144只，雌雄兼用，体重1822

7、 g，由中国医科大学实验动物中心提供随机分为3组：(1)假手术组（n=48）；(2)缺血再灌注组（n=48）；(3)TLR4阻断组（n=48）。各组又分1、2、3及4 d 4个时间点组（n=12）。1.3 小鼠脑缺血再灌注模型的制备手术在室温25、湿度50%的条件下进行。用2%戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg），络合碘消毒，行颈部正中切口，分离两侧颈总动脉（CCA)，用动脉夹夹闭小鼠双侧CCA，阻断12 min后，松开动脉夹实现再灌注。在阻断双侧CCA血流后，出现心跳加快、呼吸幅度加深、频率先加快、后减慢典型生理变化过程的小鼠为缺血成功样本入选。TLR4阻断组小鼠缺血10 min时在右侧C

8、CA内缓慢注入TLR4抗体 (10 g/ml) 0.1 ml，用微量注射泵在2 min内注射完毕，缝合切口。缺血再灌注组注射等量生理盐水，假手术组只分离双侧CCA，其余步骤同上。术中用白炽灯保持小鼠肛温（37±0.5）。术后置清洁饲养笼中观察。1.4 组织切片的准备各组动物分别于再灌注1、2、3、4 d时间点（n=6），用4的4%多聚甲醛（含1/1 000 DEPC）经左心室至主动脉灌注200 ml，在前囟尾侧2.64.6 mm间冠状切取脑组织块，后固定于上述灌流液中6 h。浸入20%蔗糖溶液中3 h，入30%蔗糖溶液4过夜沉底后，常规石蜡包埋，用切片机作连续脑冠状切片（片厚7 m）

9、。1.5 Western印迹检测TLR4、IFN表达各组动物分别于再灌注1、2、3、4 d时间点（n=6）立即冰上断头取右侧皮质，加入适量的细胞裂解液150 l，超声粉碎，离心。 用Lowry法测定蛋白浓度。取总蛋白30 g经120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。转印，杂交，暗室内ECL反应，X光片显影、定影，扫描蛋白印迹条带。1.6 TRIF免疫组化染色石蜡切片常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）浸泡5 min。3% H2O2去离子水孵育510 min，滴加多克隆兔抗鼠IgG（1100）4 过夜，加生物素化的羊抗兔IgG（1200）室温1 h。DA

10、B显色，常规脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗。1.7 图像分析及统计学处理蛋白条带用自动凝胶成像系统Chemi Imager 5500 V2.03软件进行扫描，用Fluor Chen 2.0软件进行分析测得总光密度值(IDV）。每例动物取切片3张，每张切片选取3个不连续的高倍视野，用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统测定TRIF阳性反应物的平均光密度值（MOD值）。所得数据以x±s表示，用SPSS13.0统计软件作统计分析，样本均数间比较用方差分析。2 结 果2.1 Western印迹检测TLR4表达结果缺血再灌注组TLR4蛋白表达水平明显高于T

11、LR4 阻断组和假手术组表达水平，见图1。缺血再灌注组TLR4表达条带的IDV值在1、2、3 d和4 d分别高于TLR4阻断组IDV值（P<0.05），见表1。表1 TLR4在小鼠右侧皮质表达的IDV值（略)2.2 TRIF免疫组化染色及分析结果TRIF免疫组化染色阳性表达产物呈棕黄色，位于细胞质和细胞膜，假手术组TRIF表达很少，TLR4阻断组TRIF免疫染色加深，缺血再灌注组TRIF表达比TLR4阻断组增多，缺血再灌注组TRIF阳性产物的平均光密度值大于TLR4阻断组和假手术组；缺血再灌注组TRIF在再灌注1 d开始表达，3 d达到高峰，4 d开始下降。缺血再灌注组TRIF阳

12、性表达产物的平均光密度值在1、2、3 d和4 d分别高于TLR4阻断组平均光密度值（P<0.05），见表2，图2。表2 TRIF在小鼠右侧皮质表达的MOD值(略)2.3 Western印迹检测IFN表达结果缺血再灌注组IFN蛋白表达水平明显高于TLR4 阻断组和假手术组，缺血再灌注组IFN蛋白在再灌注1 d开始表达，3 d达到高峰，4 d开始下降；缺血再灌注组IFN表达条带的IDV值在1 d、2 d、3 d和4 d分别高于TLR4阻断组IDV值（P<0.05），见表3，图3。表3 IFN在小鼠右侧皮质表达的IDV值（略)3 讨 论 TRIF是信号转导通路中关键的转接

13、分子，是信号向下游转导的关键靶分子5。TRIF可激活TBK1。TBK1由一个可诱导的IB激酶(IKKi) 家族组成6，TBK1/ IKKi直接使IRF3和IRF7磷酸化7，磷酸化的IRF3和IRF7形成同源二聚体，转移到细胞核，导致一系列IFN诱导的基因表达8。 由于TRIF是TLR4信号传导通路的一个关键分子,本研究在脑缺血再灌注损伤激活TLR4后，观察了其胞内衔接蛋白TRIF在小鼠皮质的表达。结果表明TLR4被激活后，引起其胞内衔接蛋白TRIF表达量增加，而采用TLR4抗体阻断后，TRIF表达量减少，提示TRIF参与了脑缺血再灌注TLR4激活后的信号传导路径。由于磷酸化的IRF3转位入核后

14、，可导致IFN和一系列IFN诱导的基因表达，本实验观察了IFN表达的变化，结果提示在脑缺血再灌注的病理发展过程中，TLR4TRIFIFN信号通路可能被激活，阻断TLR4后，TRIF和IFN表达量明显减少。【参考文献】 1 Georgel P，Jiang ZF，Kunz S,et al.Vesicular stomatitis virus glycoprotein G activates a specific antiviral Tolllike receptor 4dependent pathwayJ. Virology，2007;22（6）:36474.2 Lee JK，Kim SY,Kim

15、 YS,et al.Suppression of the TRIFdependent signaling pathway of Tolllike receptors by lutedinJ.Biochem Pharmacol，2009;77（8）:1391400.3 Barton GM.Viral recognition by Tolllike receptorsJ.Semi Immunol，2007;32（2）:11321.4 Menzies M，Ingham A.Identification and expression of Tolllike receptors 110 in selec

16、ted bovine and ovine tissuesJ.Veterin Immunol Immunopathol，2006;109（1）:2330.5 Yamamoto M，Sato S，Hemmi H,et al.TRAM is specifically involved in the Tolllike receptormediated MyD88independent signaling pathwayJ.Nat Immunol，2003;4（1）:114450.6 Oganesyan G，Saha SK，Guo B,et al.Critical role of TRAF3 in the Tolllike receptordependent and independent antiviral responseJ.