免疫沉淀反应IP

1、19免疫沉淀反应 IP-Immunoprecipitation免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的

2、沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。材料：1. 蛋白A 或蛋白G2. 一抗3. 免疫沉淀缓冲液：20 mM 磷酸钠，pH 7.5,500 mM NaCl,0.1% SDS,1% NP40,0.5% 脱氧胆酸钠 and 0.02% 叠氮化钠. （ NOTE: 50 mM 醋酸钠缓冲液，pH 5.0,. 500 mM NaCl,0.1% SDS,1% NP-40 and 0.02%叠氮化钠也可作为免疫沉淀的缓冲液，能提高蛋白G的结合功效）4. 洗脱液：0.1 M 甘氨酸-HCl buffer,pH 2

3、.55.SDS-PAGE上样缓冲液 (pH 6.8）：2% SDS,62.5 mM Tris 碱，10% 甘油，2-5%2-巯基乙醇步骤：1. 用50 l免疫沉淀缓冲液溶解抗原，向溶液中加入1倍过量的特异性一抗。加入免疫沉淀缓冲液至样品体积为0.2 ml。一般情况下，在此体积下2-5g的纯化抗体能够较好地形成抗原抗体复合物。2. 样品4.孵育过夜。3. 将适量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗体复合物中（ 50 l of gel per 5 g of antibody）。4. 室温下，轻柔混匀样品，孵育2小时。5. 用0.5ml免疫沉淀缓冲液洗蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物，离心2-3分钟，弃上清

4、。重复此步骤至少6次。6. 用50 l洗脱液孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟，将抗原抗体复合物从蛋白A或蛋白G上洗脱下来，离心，收集上清。另用50 l洗脱液孵育胶5分钟，离心，收上清。将两个上清混合。7. 立即调节蛋白样品的pH至生理值，用一种合适的、多次离心的缓冲液调节，如1.0 M Tris,pH 7.5 (10 l of this buffer to 100 l of the supernatant should be sufficient).8. 将洗脱成分除盐。9. 准备好样品待定性。NOTE: 如果用SDS-PAGE定性蛋白质，省去步骤6-9。在完成第5步之前，用0.5

5、ml蒸馏水洗胶。离心蛋白A或蛋白G 2-3分钟，弃上清。用25l SDS-PAGE上样缓冲液在95C孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟。样品离心，收集上清。重复一次，汇集上清至总体积50l。由此样品则准备妥当。 特发性多神经炎idiopathic polyneuritis 潜伏期/孵育期incubation perioc吞噬指数index of phagocytosis 预防感染，预防传染infection prevention数字PCR（digital PCR） 让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。因此ddPCR特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝

6、数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。ddPCR技术是通过将微量样品作大倍数稀释和分液（partitioning），直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。数字PCR原理：PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的持异结合。整个扩增过程分三步：1、变性：使DNA双链解离，形成两条单链；2、退火：温度下降

7、后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也可能存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，结合主要发生在模板与引物之间；3、延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，从引物的3端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。上述几步为一个循环，从理论上讲，每经过1个循环，样本中的DNA应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板。第2个循环开始后，模板链增加倍。仪器：伯乐生命bio-rad QX200 微滴式数字PCR (ddPCR) 系统可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析，适用于 EvaGreen 或基于探针的数字PCR应用领域。QX200 Droplet数

8、字PCR(Digital PCR) 系统的应用领域：癌症生物标志物研究和拷贝数变异分析。PFU微型生物群落监测方法(以下简称PFU法)是应用泡沫塑料块作为人工基质收集水体中的微型生物群落，测定该群落结构与功能的各种参数，以评价水质。此外，用室内毒性试验方法，以预报工业废水和化学品对受纳水体中微型生物群落的毒性强度，为制定其安全浓度和最高允许浓度提出群落级水平的基准。原理：微型生物群落在水生态系统中客观存在。用PFU浸泡水中，曝露一定时间后，水体中大部分微型生物种类均可群集到PFU内，挤出的水样能代表该水体中的微型生物群落。遗传异质性: 遗传异质性(genetic heterogeneity)是

9、指某一种遗传疾病或表型可以由不同的等位基因或者基因座突变所引起的现象。与之相对反的是基因多效性，是由某一个基因突变引起多种疾病或表型。遗传异质性分为等位基因异质性和基因座异质性。基因座异质性病是由不同基因座的基因突变引起的，如先天性聋哑有常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传和X连锁隐性遗传3种遗传方式。属于场染色体隐性遗传的有35个基因座位，占病例总数的68%。因此，常可见到2个先天性聋哑患者婚配后生出并不聋哑的孩子，就是由于父母的聋哑基因不在同一基因座位所致，即一个亲代的基因型为AAbb，另一个亲代的基因型为aaBB，两个亲代都是某基因座的纯合子患者，但他们子女的基因型为AaBb，在两个基因座

10、位上均为杂合子，故表现正常。等位基因异质性是指某一遗传病是由同一基因座上的不同突变引起的，如地中海贫血，既可能是由于珠蛋白基因点突变所致的RNA加工障碍或转录调控区改变引起的，也可能是由于珠蛋白基因缺失引起的骨髓增生异常综合症（ myelodysplastic syndrome, MDS）:是一组起源于造血髓系定向干细胞或多能干细胞的异质性克隆性疾患，主要特征是无效造血和高危演变为急性髓系白血病，临床表现为造血细胞在质和量上出现不同程度的异常变化。其具体临床表现为贫血，可伴有感染或出血，部分病人可无症状。部分患者可有肝，脾，淋巴结轻度肿大，少数患者可有胸骨压痛，肋骨或四肢关节痛。血象可呈全血细

11、胞减少，或任何一系及二系血细胞减少。1982年由FAB协作组建议确立病名，并将MDS分为五型：难治性贫血；难治性贫血伴环状铁粒幼细胞增多；难治性贫血伴原始细胞增多，转变中的难治性贫血伴原始细胞增多；慢性粒单核细胞白血病。MDS分型:1982年FAB协作组首先倡导MDS这一概念并将MDS分为五型：难治性贫血(refracrory aremia,RA)；难治性贫血伴环状铁幼粒细胞增多(RA with ring sideroblst ,RAS);难治性贫血伴原始细胞增多（RA with an excess of blast, RAEB）;转变中的难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB in transf

12、ormation,RAEB-T）;慢性粒-单核细胞性白血病（chronic myelo-monocytic leukemia,CMML）; MDS分型已由FAB标准过度到WHO标准，按照此标准将MDS分为以下八型：难治性贫血（RA）;难治性贫血伴环状铁幼粒细胞增多（RARS）;难治性血细胞减少症伴幼多系发育异常（RCMD）;难治性血细胞减少症伴有多系发育异常和环状铁幼粒细胞（RCMD-RS）;难治性贫血伴原始细胞增多-1（RAEB-1）;难治性贫血伴原始细胞增多-2（RAEB-2）;MDS，不能分类（MDS-U）;MDS伴单纯del(5q);.WHO关于MDS的分类标准对于规范和同意MDS的诊断和治疗具有非常重要的意义，但WHO 分型标准面世，不久，目前尚未得到与FAB分型同样的认可与应用。无效造血-ineffective hematopoiesis在骨髓内红细胞分裂成熟的过程中，由于某种原因使其在成熟和进入外周循环之前就被破坏，死亡，称之为无效造血，或者无效性红细胞生成，或原位溶血。无效造血包括获得性和遗传性两种情况，前者