黄冈师范学院2018年度-2018年度第二学年分子实验的考试问题详解

1、2011 2012学年分子生物学实验期末考试试卷答案一简答题1. 琼脂糖凝胶电泳别离DNA勺原理是什么？DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中， 因DNA分子的大小与构象差异而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA吉合形成一种荧光络合物，在254365nn紫外照射下可产生桔红色的荧光，可用于检 测DNA此法可观察到凝胶中2ng左右的DNA。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，当其加热到沸点后再冷却凝固就形成良好的 电泳介质，其孔径决定于其浓度。电泳介质中的孔径对电泳迁移中的带电分子产 生一种阻力，阻

2、力的大小取决于带电分子的大小与其物理性状。因此，琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，别离 DNA勺X围广，约200bp50kbb在一定电场强度下，假如无任何介质阻碍迁移，如此大DNA分子比小DNA分子跑得快。但在实际电泳中，由于使用了琼脂糖分子筛介质，对大分子DNA产生了较强的阻力，因此大分子DNA尽管有较高的带电量，仍难以快速前进；小 分子DNA由于能够穿越介质网孔，其带电量尽管相对较小，但仍能快速迁移到正 极。因此，不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中产生了不同的迁移距离，这种迁移距离的差异使得不同大小DNA寻以别离。2. 琼脂糖凝胶电泳中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？EB即溴化乙锭。因为溴化乙锭含

3、有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA勺结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和 溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面 基团与螺旋的轴线垂直并通过 X德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位 置与其与碱基的密切接近，导致与DNA吉合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离 溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的 染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光 谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有 结合DNA勺染料高出20-3

4、0倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭0.5ug/ml 时，可以检测到少至10ng的DNA条带。3. 制备基因组DNA寸用到的以下试剂CTAB巯基乙醇、氯仿、无水乙醇、70% 乙醇分别起什么作用？CTAB溶解膜蛋白，破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀；巯基乙醇：抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,防止褐变,能保护DNA另外巯基 乙醇能消除CTAB在震荡过程中产生的大量气泡；氯仿：去除蛋白质、多糖、色素等，纯化 DNA无水乙醇：沉淀DNA70%乙醇：漂洗并沉淀DNA4. 什么是感受态细菌？感受态细菌的主要作用？感受态细菌：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态细菌。主要作用：感受态的细菌适于摄取和容纳外

5、来 DNA。再者，将构建好的载体转 入感受态细菌进展表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受 态细菌作为重组载体的宿主可以进展后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。5. 简单表示质粒DNA提取过程中参加各种试剂后分别会产生什么现象，简要解 释为什么？溶液I :现象不明显。菌体重悬于溶液中。溶液U:管底出现沉淀物质。溶液II使菌体裂解、蛋白质变性，管底就会出现 一些细胞碎片和蛋白质沉淀物。溶液III :沉淀增加。乙酸钾能使 SDS产生不溶水的沉淀并将蛋白质和染色体沉淀下来。氯仿：异戊醇24:1 :现象待考溶解蛋白质和多糖等杂质无水乙醇作用：沉淀DNA70%乙醇作用：漂洗并沉淀 DNAT

6、E缓冲液作用：溶解质粒 DNA注意：实验现象自己对照实验报告写6蓝白斑筛选的原理蓝白斑筛选要筛选的是白班，因为白斑代表目的基因转入了大肠杆菌中， 蓝斑表 示没有转入。具体原理见下：蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如a -互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都 带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有B -半乳糖苷酶基因lacZ的调控 序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点MCS，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到B-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码B -半乳糖苷酶C端局部序列的宿主细 胞。因此，宿主和

7、质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成 具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为a-互补。由a-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌 落，因而易于识别。然而，当外源 DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可防 止地导致无a-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。量程的调节在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，如此按照正常的调节方法，逆时针旋转旋钮即可；但如果要从小体积调为大体积时， 如此可

8、先顺时针旋转刻度旋钮至超过量程的刻度，再回调至设定体积，这样可以 保证量取的最高准确度。在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否如此会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。枪头吸液嘴的装配在将枪头pipette tips 套上移液枪时，很多人会使劲地在枪头盒子上敲几下，这时错误的做法，因为这样会导致移液枪的内部配件 如弹 簧因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住。正确 的方法是将移液枪器垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其严密 结合。如果是多道如8道或12道移液枪，如此可以将移液枪的第一道对准 第一个枪头，然后倾斜地插入，往前后方向摇动即可卡紧。枪头卡紧的标志是略 为超过

9、0型环，并可以看到连接局部形成清晰的密封圈。移液的方法移液之前，要保证移液器、枪头和液体处于一样温度。吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下 2-3毫米。在吸液之前，可以先 吸放几次液体以润湿吸液嘴尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时。这 时可以米取两种移液方法。一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停 片刻继续按按钮至第二停点吹出剩余的液体。 最后松开按钮。二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的 液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体， 转移液体的时候不用吹出剩余的 液体。先

10、按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点 排出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点千万别再往下按， 取下有残留液体的枪头，弃之。移液器的正确放置使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。当移液器枪头里有液体 时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。维护保养时的须知事项如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。最好定期清洗移液枪，可以用肥皂水或60 %的异丙醇，再用蒸馏水清洗，自然晾干。高温消毒之前，要确保移液器能适应高温。校准是可以在20-25度环境中，通过重复几次秤量蒸馏水的方法来进展。使用时要检

11、查是否有漏液现象。方法时吸取液体后悬空垂直放置几秒中，看看液面是否下降。如果漏液，原因大 致有一下几方面：1、枪头是否匹配；2、弹簧活塞是否正常；3、如果是易挥发的液体许多有机溶剂都如此，如此可能是饱和蒸汽压的问题。可以先吸放几次液体，然后再移液。论述题1.答：1如果该目的基因为基因，且序列，如此通过数据库查到基因序列，根 据序列设计引物，PCR获得全长，凝胶回收后，与载体连接、转化、挑单克隆培 养提取质粒DNA测序验证。2如果该目的基因为新材料中的基因，且序列未知，如此可通过数据库进 展同源基因序列搜索，比对分析，根据同源性高的局部设计引物，PCR获得片段, 测序得到局部序列，根据的局部序列设计GSF引物，利用RACE分别获得5'与3' 端序列，测序拼接成全长序列，再根据 1步的步骤获得该目的基因。关键技术：引物设计，利用碱基互补原理，注意引物 Tm值、GC含量、发 夹结构、引物二聚体、错配等。连接、转化，利用 Taq酶反响加A的特性，与 T载体可以互补，连接。转化，如此是利用a互补显色反响原理，对阳性克隆进 展筛选。注意连接时目的片段与载体的摩尔比为 5: 1-10 : 1, 一般16度过夜连 接,转化时注意感受态