细胞色素P450酶诱导模型题库

1、细胞色素 P450 酶诱导模型摘要细胞色素氧化酶P450 是人体内一类参与内源性和外源性化合物代谢的重要代谢酶，代谢活化许多药物，前致癌物，前毒物，和质变剂。大约有60%的药物主要依赖细胞色素氧化酶P450 的代谢作用清除的。本文主要建立了细胞色素P450 酶的诱导模型，有望为研究新药提供参考。建立化合物对细胞色素P450 酶的诱导的模型时， 我们选择了利福平 ,奥美拉挫和苯巴比妥分别作为1A2,3A4 和 2B6 酶的诱导剂。此模型使用肝细胞来建立的，化合物加入到细胞培养液中，通过 LC-MS 来从测定代谢产物的变化。同时 , 我们进行了基因水平的检测 ,在基因水平上我们检测了化合物对细胞的

2、诱导作用 .通过此模型，我们可以直接从LC-MS 测定的代谢产物的多少来确定未知的化合物是否对细胞色素CYP450 是否有诱导作用。由实验得知，利福平,奥美拉挫和苯巴比妥对 1A2,3A4 和 2B6 的诱导能力很强，都超过20 倍。1/7前言细胞色素 P450(cytochrome,CYP450)是一类以还原态与CO 结合后在 450nm处具有最高吸收峰的含血红素的单链蛋白质。人体内代谢药物的主要酶就是细胞色素 P450 超家族 (Cytochrome P450 proteins, CYP)，它们是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的（包括大多数临

3、床药物）代谢。 P450 酶能通过其结构中的血红素中的铁离子传递电子，氧化异源物，增强异源物质的水溶性，使它们更易排出体外。美国的一项研究表明，住院患者的严重不良反应发生率为6.7，因药物相互作用的致死率已排名住院患者死亡原因的第4 5 位1 。近 20 年内，美国 IDA先后已将批准上市的数十种新药从市场撤出， 其最主要的原因就是出现了严重的药物代谢性相互作用 2 。诱导药物代谢是药物在代谢过程中诱导 CYP450 酶的表达或者 CYP450 酶的功能上调， 从而加快药物的代谢速率， 影响了临床药效或者引起药物中毒的一种代谢方式。新药对CYP450 酶的诱导作用已经越来越受国际医药界的重视，

4、新药对CYP450 酶诱导能力评价已经正式成为FDA 的标准之一。生物体中的酶分为两种，分别为结构酶和诱导酶，CYP450 酶是个很大的家族，其基因就超过了 200 种，一小部分基因数量稳定在细胞中被持续的转录和翻译，我们称之为结构酶， 另一部分酶需要受到化学物质或者激素的刺激才能被表达，我们称之为诱导酶。药物对细胞色素P450 产生诱导的主要机制是基因转录水平的提高。绝大部分的CYP450 酶的基因转录的增加是通过核受体介导的机制。CYP 酶的基因活化主要有三种受体调控： 孕烷 X 受体（ PXR）,雄烷受体 (CAR) ，【 3】和芳烃受体（ AhR）。正常情况下，核受体与其对应的阻截物结

5、合，保证基因转录水平的稳定性， 但是当诱导药物存在时， 药物会和受体配基的结合区域【4】结合，并且使阻截化合物解聚，从而促使染色质变质和基因转录。CYP450 酶的家族很大，主要分为三类：CYP1 家族， CYP2 家族，CYP3家族 27,28 。我们在实验中选取了 CYP450 酶的 1A2， 3A4 和 2B6 进行了诱导能力的评价。 CYP3A4 ，CYP1A2 和 CYP2B6 的诱导分别由 PXR，CAR 和 AhR 介导，因此我们对 CYP450 家族进行的体外诱导实验只需要选取这三个酶就可以了。根据 FDA 的报道利福平 ,奥美拉挫和苯巴比妥分别是1A2,3A4 和 2B6 酶

6、强2/7诱导剂，所以我们选取了这三个化合物来进行我们的实验。研究 CYP450 酶的诱导主要有肝实质细胞培养法，肝切片法，基因重组 P450酶系以及肝灌流技术。2 实验方法2.1 主要试剂及器材试剂：化合物（底物，内标和诱导剂）：非那西汀（Phenacetin）和咪达唑仑（ Midazolam）和安非他酮（Bupropion），对乙酰氨基酚 -d4（Acetaminophen-d4），1'-OH-咪达唑仑 -13C3（ 1'-OH-Midazolam-13C3），利福平（ Rifampicin ）, 奥美拉挫（ Omeprazole）, PBS（磷酸缓冲溶液）， DMEM F1

7、2 购买于西格玛。甲醇，乙腈和醋酸胺是色谱级均购买自美国Sigma-Aldrich 公司。甲酸是色谱级购买自美国 TEDIA 。主要酶体系 ：人的肝细胞购买于 IVT 。仪器：样品分析采用API5500： 串联质谱样品分析采用应用生物API5500 三重四级杆质谱仪(安大略，加拿大) 配有电喷雾离子源，接口处连接WatersACQUITYUPLC?(Waters，美国 ) 液相系统，液相系统配有二元泵，自动进样器，柱温箱。液相系统和数据采集均由软件控制，软件来源于美国应用生物公司。2.2 常用试剂的配制（ 1）磷酸盐缓冲溶液（ 100mM磷酸钾溶液）配制溶液 1:精密称量 136.5克磷酸钾，

8、加1L蒸馏水溶解。配制溶液 2：精密称量 174.2 克磷酸二钾，加 1L蒸馏水溶解。取 40.5ml溶液 2和9.5ml溶液 1混合，用蒸馏水定容到 500ml。测定 pH值，调至 7.4，于 4度冰箱保存。（ 2）底物的配置3/7CYP底物Stock Con.Final Con.1A2非那西汀10 mM30 M3A4咪达唑仑1.67 mM5 M2B6安非他酮50 mM70 M（ 3）内标的配置IsoformISStock Conc.Final Conc.1A2对乙酰氨基酚 -D410M0.1M3A41'-OH- 咪达唑仑 -13C310M0.1M2B6OH- 安非他酮 -D636M

9、0.36M(100 ng/mL)2.3 细胞培养及药物处理使用的肝细胞购买于IVT ，培养液选用 DMEM:F12 培养基，在 5%二氧化碳培养箱中 37°C 培养。细胞 24 孔培养板预处理：在细胞 24 孔培养板铺上鼠尾胶原， 37°C 培养箱放置 3 小时，吸出鼠尾胶原，用 PBS 清洗细胞 24 孔培养板，放置 -80 °C 保存。使用前用 PBS 清洗。从液氮罐中取出人肝细胞， 在 37°C 水浴中快速溶解。 用 DMEM:F12 清洗细胞，计数，肝细胞 56x105 在 DMEM:F12 溶液中，培养细胞。化合物配制在DMEM:F12 培养基

10、中，连续三日换液（含化合物）后，加入底物，测试底物的代谢产物，从而判定化合物是否对酶有诱导。3.试验结果3.1 酶活在化合物或参照物与人肝细胞培养72 小时后，与阴性对照（以DMSO代替化合物或参照物） 相比，通过三种 CYP 酶（CYP1A2 ，CYP3A4，CYP2B6）4/7的特异性底物产生的代谢产物的量，来评估化合物对三种CYP 酶的诱导作用。试验结果见表1表 3。表1：在化合物或参照物（Omeprazole）与人肝细胞培养 72小时后， CYP1A2 酶活的变化Test ArticleConcentrationFold of induction( M)Donor 1Donor 1Do

11、nor 1Donor 1Donor 1DMSO only-11110.00Omeprazole25284.218.616.90.71表2：在化合物或参照物（Phenobarbita ）与人肝细胞培养 72小时后， CYP2B6 酶活的变化Test ArticleConcentrationFold of induction( M)Donor 1Donor 2Donor 3MeanRSDDMSO only-11110.00Phenobarbital7508845.81148.380.80表3: 在化合物或参照物（Rifampicin ）与人肝细胞培养 72小时后， CYP3A4 酶活的变化Test

12、 ArticleConcentrationFold of induction( M)Donor 1Donor 2Donor 3MeanRSDDMSO only-11110.00Rifampicin255.38.111.78.340.383.2 mRNA 表达水平在化合物或参照物与人肝细胞培养72 小时后，与阴性对照（以DMSO代替化合物或参照物） 相比，通过三种 CYP 酶（CYP1A2 ，CYP3A4，CYP2B6）的 mRNA 水平的表达，来评估化合物对三种 CYP 酶的诱导作用。试验结果见表 4。5/7表 4：在化合物或参照物与人肝细胞培养72小时后， mRNA 表达水平的变化Enzym

13、eIsoformFold of Change *Donor 1Donor 2Donor 3MeanRSD1A2Omeprazole22.7111.048.2614.010.552B6Phenobarbital17.224.4210.4410.690.603A4Rifampicin11.7912.2418.8714.300.28*Fold of Change = 2 -CTN/A: Not Acquired.3.3 在化合物或参照物与人肝细胞培养72 小时后，人肝细胞的存活率在化合物或参照物与人肝细胞培养 72 小时后，通过 CytoTox-Glo? 试剂盒检测细胞内特异性酶的释放来表征细胞膜的

14、完整性，进而检测细胞的存活率。试验结果见表 5。表 5：在化合物或参照物与人肝细胞培养72小时后，人肝细胞的存活率SampleConcentrationCell Viability (%)Name( M)Donor 1Donor 2Donor 3MeanRSDDMSO only-88.4392.9388.6490.000.03Omeprazole2591.3890.0894.9992.150.03Phenobarbital75091.0692.0687.5790.230.03Rifampicin2592.5289.2693.6391.800.026/74. 结论：4.1 在参照物与人肝细胞培养72 小时后，CYP1A2 的参照物 Omeprazole，CYP2B6的参照物 Phenobarbital和 CYP3A4 的参照物 Rifampicin ，在酶活和 mRNA 的水平上均表现出明显的增加。在CYP1A2 方面，