Elisa实验药品步骤及相关材料精品文档17页

1、本实验室 Elisa所需试剂器材1. 试剂(1) 包被缓冲液 碳酸盐缓冲液 (PH9.6 0.05M) ：Na2 CO3 1.59gNaHCO32.93g加蒸馏水至1000ml作用：稀释抗原（菌悬浮液）(2) 洗涤缓冲液 PBST (PH7.4 0.15M) ：KH2PO40.2gNa2 HPO412H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2gTween-200.05 0.5ml加蒸馏水至1000ml作用：洗涤(3) 缓冲液 PBS (PH7.4 0.15M) ：KH2PO40.2gNa2 HPO412H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2g加蒸馏水至1000ml作用：制备封闭液第 1页(

2、4) 封闭液：牛血清白蛋白 (BSA) 0.1g ，加缓冲液（PBS）至 100ml 或PBS加 2 BSA作用：封闭空隙(5) 稀释液： PBST 加 1牛血清白蛋白 (BSA)作用：稀释抗体及酶标抗体(5)HRP 羊抗兔 IgG 一酶标抗体作用：结合抗体(6) 底物缓冲液 磷酸盐柠檬酸 (PH5.5):0.2M Na 2HPO4(28.4g/L)25.7ml0.1M 柠檬酸 (19.2g/L)24.3ml蒸馏水 50ml作用：制备TMB(7) TMB(四甲基联苯胺 ) 使用液 :TMB(10mg/5ml无水乙醇 ) 0.5ml底物缓冲液 (PH5.5)10ml0.75 H2O232l作用：

3、显色(8) 终 止 液 (2M H2SO4 ）： 蒸 馏 水 178.3ml ， 逐 滴 加 入 浓 硫 酸(98 )21.7ml作用：终止反应2. 器材 :聚苯乙烯塑料板 ( 酶标板 )96 孔第 2页抗原制备：以平板划线法将供试菌菌接种于普通营养琼琼脂培养基上，28 培养 24 h后，挑取单菌落接种于LB 液体培养基中，过夜培养；5 000 r min -1 离心 10 min ，弃上清；加入 1%的甲醛于37 灭活 24 h ，通过菌落涂布法检测灭活效果； 5 000r min-1 离心 10min，弃上清，用麦氏比浊法，配制出浓度约为1109 cells mL-1 的菌悬液作为免疫抗原

4、。抗血清制备：抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG。大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG 蛋白。其基本步骤如下：(1) 取抗血清 0.2 ml ；(2) 加生理盐水（ 0.85 NaCl ） 0.3 ml ，混匀；(3) 逐滴加入饱和 (NH4) 2SO4 0.5 ml ，充分振荡混匀， 4静置 1 h ；(4) 10000 rpm/min 离心 20 min ，弃上清；(5) 加 0.5 ml 生理盐水重悬浮，混匀；(6) 0.25 ml 饱和 (NH4) 2SO4，充分振荡混匀， 4静置 1 h ；(7) 10000 rpm/min 离心 20 min ，弃上清

5、；(8) 重复 58 步骤一次；(9) 加生理盐水 0.5 ml 重悬浮，混匀；(10) 生理盐水中透析 12 24 h ；(11)在 0.2 M pH 9.0硼酸缓冲液透析12 24 h ；(12)分装，即将使用时4保存，备用 - 20保存。第 3页为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为3 M KCNS 透析，促使聚合的多聚体解聚。硫酸铵法纯化血清 IgG 粗品 : 取 1 份血清加入 1 份生理盐水进行稀释 ,边搅拌边加入2 倍原血清体积的饱合硫酸铵, 室温放置 30min, 7 000r /min离心 30min;沉淀溶于原血清

6、体积的生理盐水中, 加入 1 倍体积的饱合硫酸铵 , 室温放置 30min, 重复第二步 , 将沉淀溶于 1/ 10原血清体积的生理盐水溶液中 , 在 0. 0175 mol/ L pH6. 3 PB4+缓冲液中透析至无 NH 为止。免疫血清效价的测定：采用试管凝集法测定抗血清的效价。ELISA 检测流程：用 pH 9.6 的 0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液稀释抗原，加入96 孔聚苯乙烯酶标反应板孔内，每孔100 L，60 烘干，用PBST缓冲液（注满孔）洗涤 3 次；每孔加入 300 L 2 BSA -PBST封闭液， 37 封闭 1 h ， PBST缓冲液洗涤 3次；每孔加入 100

7、L 适当稀释的阳性血清和阴性血清，37 反应 1 h ， PBST缓冲液洗涤3 次；每孔加入100 L的羊抗兔 IgG-HRP酶标抗体， 37 反应 1h； PBST 缓冲液洗涤 3 次；加新配制的TMB-H2O2 底物溶液（临用15 分钟内），每孔 100 L，37 避光反应20min；以 50 L2 mol L-1 H 2SO4 终止反应； 15 分钟内用酶标检测仪读取OD450值，以判定结果。抗原最佳包被浓度和免疫血清最适稀释度的确定：第 4页棋盘法：将 1x109 CFU mL的菌体悬液梯度稀释至lxl0 5 CFUmL，使抗血清做 1:2000 、1：5000、1 10 000 、1

8、15 000 、1 20 000 稀释。酶标抗体做 1： 1000 稀释，每个稀释度包被3 个孔，进行间接ELISA 测定。以能产生 OD450值为 1.0 左右，且 PN 值最大的为抗原抗体最佳稀释度。酶标二抗最适稀释倍数确定：在确定的抗原抗体最佳工作浓度下，将酶标二抗稀释为1：l000 、l ：2000、l ： 5000、 l ： 10000、1： 20000 5个稀释比试验，依据其OD450值在 1.0 左右的选择为最佳二抗稀释比，且P N值最大为最佳稀释度。硼酸缓冲液一般PH6.779.24A 液： 0.2mol/L硼酸 0.05mol/L NaCl配方：硼酸 :1.2368g ， N

9、aCl 0.2925g,加蒸馏水至100mlB 液： 0.05mol/L硼酸钠配方：硼酸钠1.907g, 加蒸馏水至100ml不同的 PH值配方如下：PHA(ml)B(ml)PHA(ml) B(ml)6.779.70.38.41 5.54.57.099.40.68.51 5.05.57.369.01.08.60 4.56.07.608.51.58.69 4.06.07.788.02.08.84 3.07.07.947.52.58.982.08.0第 5页8.087.03.09.111.09.08.206.53.59.240 10.08.316.04.0透析袋使用前处理：1. 把透析袋剪成适当长

10、度（ 10-20cm）的小段。2. 在大体积的 2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0) 中将透析袋煮沸 10 分钟。3. 用蒸馏水彻底清洗透析袋。4. 放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0) 中将之煮沸 10 分钟。5. 冷却后，存放于 4 度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。6. 用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。透析膜 ( 前处理方法如下 ) ：1.戴手套把透析膜剪成适当长度，浸在蒸馏水中15 min 泡软。2.浸入 10 mM 碳酸氢钠中，并加热至 80，一边搅拌至少 30 min 。3. 换到 10 mM N

11、a2EDTA中浸泡 30 min ，以新鲜的 EDTA 同样方法处理三次。4.再用 80 蒸馏水洗30 min ，然后换到20% 酒精中，放在4 冰箱中保存。方法一：1、 把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。第 6页2、在大体积（ 500mL）的 2%（W/V）的碳酸氢钠和1mmol/L EDTA.2Na(pH=8.0)中将透析袋煮沸10min。3、 用蒸馏水彻底清洗透析袋。4、 放在 500mL的 1 mmol/L EDTA.2Na (pH=8.0)中将之煮沸10min。5、 冷却后，置于30或者 50%的酒精中，放于4冰箱，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋必须戴

12、手套。6、 在使用前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗干净。说明：透析液的配置：10g NaHCO3 + 186.6mg EDTA.2Na + 500mL 蒸馏水1 mmol/L EDTA.2Na ：即 373.2mg/L方法二：可用沸水煮5 至 10 分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。方法三：可先用 50乙醇煮沸 1 小时，再依次用 50乙醇、 0.01 mol/L 碳酸氢钠和 1 mmol/L EDTA（pH=8.0 ）溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。说明：1.EDTA煮主要是为了除去生产时附着在透析袋上的金属离子。2. 透析袋的截留分子量 3000kd。使用后的透析袋保存方法：1. 用生理

13、盐水浸泡以去掉蛋白，并用蒸馏水清洗干净，然后置于 50乙醇第 7页中保存即可；2. 用完以后 , 要彻底洗干净 , 透析袋也可以保存在 0.1%叠氮钠（可防止微生物生长）里； 0.05%-0.1%叠氮钠，或者1mM EDTA，或者 50甘油中 4 度保存，公司的人建议前两种保存比较好！3. 使用后的透析袋洗净后可存于 4蒸馏水或者 30%乙醇中，确保透析袋始终浸没在溶液内。若长时间不用，可加少量 NaN2，以防长菌。从此时起取用透析袋必须戴手套。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。实验操作：1 、取空白酶标板，于每孔中加入纯化蛋白溶液100L，于振荡器上震荡混匀

14、，用封口膜封盖酶标板，室温包被过夜。2、取下封口膜，弃去酶标板内溶液，用洗剂液（1PBST）洗剂酶标板5次，最后一次吸干。每孔加入1%BSA封闭液 100L， 37 封闭 1h。3、取下封口膜，弃去酶标板内溶液，用洗剂液（1PBST）洗剂酶标板5次，最后一次吸干。每孔加入一抗血清100L， 37封闭 1h。4、取下封口膜，弃去酶标板内溶液，用洗剂液（1PBST）洗剂酶标板5次，最后一次吸干。每孔加入酶标二抗兔抗羊IgG- HRP100L， 37封闭1h。5、取下封口膜，弃去酶标板内溶液，用洗剂液（1PBST）洗剂酶标板5次，最后一次吸干。每孔加底物A 50L和底物 B 50L，震荡混匀，室温显

15、色 10 15min。第 8页6、 每孔加入终止液50L，立刻在酶标仪450nm波长下读取OD值。加样孔OD 值检测血清其他血清阴性血清或未免血清（只加稀释液或未免血清、酶标二抗，底物显色液A、B 及终止液）酶空白孔（只加酶标二抗，底物显色液A、B 及终止液）底物空白孔（只加底物显色液A、B 及终止液）纯空白孔（只加终止液）抗血清的纯化(Purification of antiserum)抗血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分，以防止抗体外的其他血清成分对试验结果产生影响。因此只能根据不同目的的要求，从抗血清中除去容易干扰的有关成分，或提取相应的免疫球蛋白。抗血清纯化的方法主

16、要有粗提法和精制法两个过程。粗提法主要常用硫酸铵盐析法，精制法分非特异性和特异性两种类型。非特异性方法如葡聚糖凝胶过滤法、离子交换层析法，其方法均系基于蛋白质分子的物理性质。特异性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗体的特异性反应。一、盐析法第 9页(Salt fractionation)【实验原理】蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，血清 球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离。【主要试剂与器材】1. 饱和硫酸铵溶液取 500ml 蒸馏水加热至7080，将 400g 硫酸铵溶于其中，搅拌20min，冷却。待硫酸铵结晶沉于瓶底，其上清即为饱和硫酸铵。在使用前

17、用28%氨水调 pH7.0 。2. 兔血清(含抗体 )。3. 透析袋、离心机等。【操作方法】1. 用 55%饱和硫酸铵提取血清中 、 球蛋白血清 1 份加生理盐水1 份混匀 , 然后逐滴加入饱和硫酸铵2 份中 , 边加边搅拌 , 防止形成团块降低沉淀物的特异性. 混匀后静置 30min 或置 4冰箱过夜。低温高速10 000/min 离心 10min，将上清液 ( 含白蛋白 ) 弃去，取沉淀物( 含球蛋白 ) 溶于少量生理盐水中。2. 用 33%饱和硫酸铵提取 球蛋白将上述提取物生理盐水溶液2 份加 1 份饱和硫酸铵。然后再10 000/min离心，其余操作同上。3. 按同样方法用 33%饱和

18、硫酸铵再提取 1 次。4. 将提取物装入透析袋，在生理盐水中透析，以除去其中所含的硫酸铵。第10 页放 - 20冰箱保存。【结果判断】用双向免疫扩散法和免疫电泳法检测抗体活性、效价和纯度。【注意事项】1. 用于盐析的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸盐等，最常用的是硫酸铵，因为硫酸铵饱和溶液所含盐浓度很高，溶解度受温度影响小，一般不引起蛋白质变性，但不纯的硫酸铵含重金属，会影响蛋白质生物活性，故应用分析纯试剂。2. 中性盐浓度不同浓度硫酸铵，当达到20%饱和度时，可沉淀血浆中纤维蛋白原，增加饱和度至28%33%，可使优球蛋白析出，当饱和度大于50%则可析出白蛋白。3.pH当溶液 pH

19、调至蛋白质的等电点，使所带阳电荷与阴电荷相等时，易使蛋白析出。球蛋白等电点为pH58。4. 蛋白质浓度如血清蛋白的浓度自0.5%递增至 3%时，所需中性盐饱和度的最低极限度可从29%递减至 24%，但当蛋白质浓度增高后，蛋白质的共沉作用也增加，影响蛋白质纯化，故当溶液内蛋白质浓度过高，可做适当稀释，一般认为2.5% 3.0%的蛋白浓度较好。5. 温度盐析蛋白时温度要求并不严格，一般在室温(25 ) 比在0时更易析出，除非盐析对温度敏感的蛋白质( 如抗体 ) 要求在 4进行。6. 透析除盐透析液内 NH4+的检测可用纳氏试剂， 如产生黄色沉淀证明NH4+的存在。【应用与评价】第11 页经盐析法提

20、取的蛋白质为粗提的免疫球蛋白，若要获得纯化的免疫球蛋白，必须经凝胶过滤或离子交换层析提纯。【思考题】1. 盐析法粗提免疫球蛋白的原理是什么？2. 盐析法粗提免疫球蛋白有哪些注意事项？二、凝胶过滤法(Gel filtration)【实验原理】利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶做为介质，可分离提纯分子量不同的大分子物质。在凝胶过滤过程中，分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间空隙先流出凝胶柱外；分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢而最后流出柱外，这样就能将分子量不同的物质分离。【主要试剂与器材】1. 待提纯样品。2.Sephadex G-200 。3.2.5 100mm层析柱。4

21、. 洗脱液0.01mol/L pH7.2 7.4PBS( 含 0.14mol/L NaCl)。5.751 紫外分光光度计。【操作方法】1.处理凝胶将 Sephadex G-200 用蒸馏水竟充分膨胀后进行浮选。2.装柱在层析柱底部铺加一层尼龙纱，然后将洗脱液和凝胶粒子沿插入柱底的玻璃棒缓缓倾注于层析柱内。第12 页3. 加样在凝胶柱表面再加一层尼龙纱，沿管壁缓缓加入样品，所加样品体积不超过凝胶柱的10%。4. 洗脱洗脱液洗脱，流速20ml/h 。待样品洗脱下来( 用 20%磺基水杨酸检测 ) 即用试管分段收集。5. 检测在紫外分光光度计上测定各管样品的A280nm值。【结果判断】以 A280n

22、m值为纵轴，收集管次序为横轴，绘出各洗脱峰，并分别收集各峰的洗脱液，再分别进行蛋白质定量与性质和纯度的鉴定。用已知标准抗体，采用双向琼脂扩散试验、免疫电泳法鉴定蛋白质性质和纯度。【注意事项】1. 膨胀凝胶时，需将凝胶干粉慢慢加入到盛有10 倍水的烧杯内，边加边用玻璃棒轻轻搅动，待被浸泡膨胀的凝胶粒沉下，倾去上层水份及内含的细颗粒，换蒸馏水数次，浸泡过程搅动要温和轻慢，以免损坏凝胶颗粒，装柱前一定要达到充分膨胀并换洗脱缓冲液(PBS) 再平衡，换 PBS2 3 次，待装柱用。2. 一般常用的洗脱缓冲液 pH和离子强度以能使样品稳定为原则。血清蛋白成分的分离纯化，多采用 pH6.9 8.0 之间磷

23、酸盐缓冲液或 pH8.0 Tris-HCl 缓冲液。3. 样品洗脱结束后，凝胶即已再生。依次装柱可反复使用多次。凝胶悬液加防腐剂后于 4冰箱内可保存数月。【应用与评价】凝胶过滤法广泛应用于生物高分子的蛋白质、酶、核算等的分离和提纯；第13 页凝胶过滤法还可用来测定蛋白质分子量，需取已知分子量样品作为标准对照；血清中存在异常免疫球蛋白，经凝胶过滤得到与正常人不同的峰形。【思考题】凝胶过滤法纯化抗体的原理是什么？三、离子交换层析法(Ion exchange chromatography)【实验原理】离子交换层析是从血清包括抗血清中分离纯化IgG 的重要方法。它是利用带电离子的纤维素( 如 DEAE

24、纤维素 ) ，吸附带相反电荷的蛋白质，又因各种蛋白质的等电点不尽相同，在一定pH 条件下，所带电荷量不等，与纤维素结合的能力有别。当用pH7.4 磷酸缓冲液 (PB) 洗脱时，人血清蛋白中IgG 所带电荷最少，与纤维素结合最差，故最先被洗脱下来，从而可达到分离纯化目的。【主要试剂与器材】1. 蒸馏水、 0.5mol/L NaOH 、0.01mol/L pH7.4 PBS 、20%三氯醋酸。2. 混合正常人血清、 DEAE纤维素。3. 层析柱、烧杯、 pH试纸。【操作方法】1. 用蒸馏水浸泡适量 DEAE纤维素过夜，除去飘浮物，再用 0.5mol/L NaOH浸泡 30min，反复用蒸馏水洗，

25、可用 2 000r/min 离心或布氏漏斗抽滤分离，直到洗至约 pH7.4，用 0.01mol/L pH7.4 PBS 再洗一次后装柱。2. 用相同的 PBS平衡至 pH7.4，当柱上端的 PB液凹面与纤维素相切时，加第14 页入一定量的血清，待血清渗入柱内与柱面相切时，立即沿管壁加少量洗脱液至形成 1cm液层后，用0.01mol/L PBS洗脱，控制流速为1ml/min 。3. 分管收集 , 每管吸取少量洗脱液，加 20%三氯醋酸测蛋白，合并、保留蛋白含量较高的洗脱液。4. 将含 IgG 的洗脱液装入透析袋内，用蔗糖或大分子聚乙二醇包埋过夜，水份析出，袋内 IgG 被浓缩。 IgG 可短期保

26、存于 4冰箱中备用。【结果判断】用单向免疫扩散试验测定浓缩液 IgG 含量，用抗人全血清作免疫电泳测定纯度，如纯化成功，应只在IgG 部位出现沉淀线。【注意事项】1. 纤维素装柱时，不能出现断层、气泡，柱面要平整。2. 缓冲液平衡要充分。3. 加血清量不宜过多。【应用与评价】该方法是目前最广泛应用的高分子物质提纯方法之一。总 IgG 或特异性 IgG均可用本法纯化。纯化的IgG 杂蛋白少，可做为免疫原、包被用抗体或用标记物标记。【思考题】离子交换层析纯化IgG 的原理是什么？附单克隆抗体制备简介目前，商品单克隆抗体已有数百种,常规使用的单抗试剂盒已广泛地用于第15 页病原体 ( 病毒、细菌、寄生虫)、肿瘤标志物、激素、自身抗体、细胞