医药生物技术产品的后处理工程

1、医药生物技术产品的后处理工程第一节第一节 细胞破碎与固液分离细胞破碎与固液分离 细胞壁由坚固的多聚糖，乙酰葡萄糖胺和乙酰胞壁酸形成网状结构，这种结构，有一定的阻力，针对这种结构，细胞破碎方法分为机械和非机械两种方法。机械破碎法机械破碎法高速匀浆法(High Pressure homogenizer)高速珠磨法(High-speed bead mill)超声破碎法(Ultrosonication)高压挤压法: 本方法是用特殊装置X-Press挤压机.非机械破碎法非机械破碎法酶溶法酶溶法(Enzymatic Lysis): 常用的溶酶有溶菌酶(Lysozyme), 葡聚糖酶(Glucanase),

2、 蛋白酶(Protease), 糖苷酶(Glycosidase), 甘露糖酶(Mannanase), 肽键内切酶(Endopeptidase), 壳多糖酶(chitinase)等。2. 化学渗透法（化学渗透法（Chemical Permeation）: 这种方法的优点是：a. 对目的产物的释出有一定的选择性； 细胞外形保持完整，碎片少，有利于进一步分离纯化； 分子量大的核酸释出少，浆液黏度低，有利于提取；其缺点是： 操作时间长，效率低，一般胞内目的产物释放率不超过 50%，而处理时间在2小时以上，因此为了防止活性损失往往需要加添还原剂（巯基乙醇）进行保护；b. 有些化学试剂本身有毒性，进一步分

3、离纯化时需通过透析等 方法除去所有试剂。固液分离固液分离离心沉淀: 离心是固液分离的主要手段,其中包括高速离心和超速离心.过滤: 过滤包括粗滤(布、金属网、纤维滤器等)和膜过滤。第二节第二节 目的产物的分离纯化目的产物的分离纯化 目前分离纯化最好的方法是色谱和电泳，但是受各种因素的限制，电泳远不能用于医药生物技术产品的规模生产上，因此色谱成为人们研究的重点。另外，双水相萃取也是前期分离常用的方法。双水相萃取双水相萃取 双水相系统由两种水溶高聚物如聚乙二醇葡聚糖(PEG-Destran)或一种高聚物与无机盐在水溶液中混合而成。因两相均含有较多的水,所以称之为双水相。常用的双水相系统为PEG-De

4、stran和无机盐。由于Destran价格高，因此PEG-无机盐应用更为广泛。 与色谱分析相比。 双水相萃取所能达到的纯度还相差较远。二二. 色谱技术色谱技术 色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段。其优点是具有多种分离机制、设备简单、便于自动化控制以及分离过程中无发热等有害效应。 色谱技术可分为分析色谱（10mg) 、半制备色谱（1050mg）、制备色谱（100mg10g）和工业性生产色谱（20g/d）。 在传统的色谱技术基础上，七十年代以来，发展起来的高效液相色谱（High Perfomance Liquid Chromatography HPLC）引人注目。HPLC的分离原理和

5、常规色谱技术相似，它的特点是具有专有的高压输液系统、灵敏的检测设备和高效分离柱，其优点是分离效率高、选择性好，适用于各种多组分混合物的分离，它的应用范围几乎包括了所有的物质类型，从天然产物到合成产物，从小分子物质到大分子物质，从一般化合物到生物活性物等。HPLC既是精细的分离纯化方法。也是快速灵敏、准确、简便的分析检测手段。 体积排阻色谱 (Size Exclusion Chromatography, SEC) SEC一般能分离的分子量范围为1200万；平均粒度为313。2. 离子交换色谱离子交换色谱 (Ion Exchange Chromatography, IEC) 离子交换色谱的基本原理

6、是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离。 对生物大分子进行分离纯化可采用两种方式： （1）. 是将目的产物离子化，被交换到介质上，而杂质不被吸附，从柱中流出，称之为“正吸附”其优点是目的产物纯度高，而且可达到浓缩目的。 （2）. 另一种方式是将杂质离子化后被交换，而且目的产物不被交换直接流出，这种方式称之为“负吸附”。采用这种方法可除去50%70%的杂质，适用于目的产物浓度较高的工作溶液。 反相色谱 (Reversed Phase Chromatography, RPC) : RPC是基于溶质，极性流动性和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱方式。4. 疏水作用

7、色谱 (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) HIC的原理与PCR相似，区别是HIC填料表面的疏水性没有RPC强，可用填料有有机聚合物(交联琼脂糖 Sepharose12，乙烯聚合物等)和大孔硅胶键合相两类。 亲和色谱（Affinity Chromatography, AC） AC是利用生物大分子特异的亲和力而建立的层析技术。亲和分析的过程大致分为三步：a. 配基固定化，选择合适的配基与不溶性支撑载体偶联或共价结合成具有特异亲和性的分离介质；b. 吸附目的物，亲和层析介质选择性吸附目的蛋白，而杂质与层析介质间没有亲和作用，不被吸附，可经洗涤去

8、除；c. 样品解析：选择合适的条件，将吸附在亲和介质上的目的物解析下来。抗体亲和层析的步骤是：a. 用纯化的目的基因蛋白质产品免疫动物，获得 抗体；b. 把抗体置于亲和层析柱上，然后使基因工程制 备的含有多种杂蛋白的混合液，通过层析柱， 具有目的基因的蛋白质产物可与柱上的抗体发 生亲和结合；c. 洗脱柱上蛋白质，可以得到高度纯化的产物。电泳分离技术电泳分离技术 电泳技术分离纯化的基本原理是：蛋白质或多肽分子是含有可带正电荷的氨基、亚氨基、酰胺基等和可带负电的羧基、苯酚基、巯基等的两性生物大分子，带有正电荷的蛋白质分子在电场作用下向阴极方向移动，而带负电荷的蛋白质分子向阳极方向移动。 平板电泳：

9、 平板电泳分为水平平板电泳和垂直平板电泳种方式。2. 连续凝胶电泳： 连续凝胶电泳实质上是垂直聚丙烯酰胺凝胶平板电泳的发展，实现了在同批次连续把各个电泳区带分离回收，并可进行多批次的分离操作。 等点聚焦电泳: 含有多氨基，多羧基的一系列聚合物混合形成的两性电解质，在电场作用下，可以形成一个从阳极到阴极PH值逐渐增加的PH梯度。当不同的蛋白质处在这种环境时，处于比其等电点低的PH环境中的蛋白质会带正电荷，向阴极方向移动，反之向阳极方向移动，在移动的过程中随着环境PH的改变，逐步达到与其等电点相同的PH环境中，这是其所带电荷为零在电场不再移动而形成区带，从而达到不同蛋白质分离的目的。4. 连续流动

10、电泳： 连续流动电泳是在纸电泳的基础上发展起来的，以滤纸为载体，将欲分离的样品以固定方式不断加在滤纸上（加阳点位置根据组分的电泳行为确定）。在电场作用下带不同电荷的组分随电泳缓冲液向前流动的同时，向不同电极方向移动，在滤纸表面形成不同的抛物线状的迁移轨迹，在滤纸末端剪成锯齿状，分别接收流出的各个组分，达到分离末端物的目的。 无载体连续流动电泳: 这种电泳的原理是，含蛋白质的溶液沿平板表面流动，形成液膜，在液膜两侧加上电极，随着液膜向前流动的同时，又向电极方向迁移，形成抛物线轨迹，使它们彼此分开，分别收集即可达到分离的目的.表表1. 某些生物大分子的分离和纯化某些生物大分子的分离和纯化表2 几种

11、检测目的物纯度方法的比较第三节第三节 目的产物的质量检控目的产物的质量检控纯度分析纯度分析 常用的纯度检测方法有: PAGE、SDS-PAGE、毛细管电泳（CE）、等电聚焦（IEF）、HPLC等，也可用一些化学方法，如观察末端是否均一等。氨基酸分析氨基酸分析 氨基酸分析可以用自动分析仪进行，氨基酸分析可分为柱后反应法和柱前反应法两类。重组蛋白质的浓度测定和分子量测定重组蛋白质的浓度测定和分子量测定 蛋白质的浓度测定；紫外法比较方便，又不损耗蛋白质样品。在未知摩尔消光系数的情况下，可以简单地测定280nm和260nm光吸收值，然后用公式计算： 蛋白质浓度 用考马斯蓝G-250测蛋白质浓度时，是在

12、酸性条件下使试剂与蛋白质产生反应，其特征吸收率由465nm转移到595nm ，在一定蛋白质浓度范围内595nm的吸光度与蛋白质浓度成线形关系，因此可作为定量依据。 凝胶过滤法是测定蛋白质分子量的最常用的方法，已广泛使用的是Sephadex系列（G-75，G-100等）和HPLC凝胶过滤系统。SDS-PAGE是实验室测定蛋白质分子量的常规方法。四四. 肽谱分析肽谱分析 肽谱分析是用酶解或化学降解（溴化氰法等）目的蛋白质后对生成的肽段进行的分解分析，它也是检测目的产物的指标之一。 蛋白质的二硫键分析蛋白质的二硫键分析 二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，测定巯基的方法有PMCB法、DTNB法和

13、NEMI法等。基因工程目的产物的硫-硫键是否正确配对，是一个重要问题，例如IL-2分子中有Cys-58和Cys-105形成的硫-硫键，而Cys-125是以游离巯基形式存在，如果发生错误配对，不但生物活性只有原来的1/400而且会形成抗原性。为此用蛋白质工程法将IL-2的Cys-125改为Ser或Ala，使其生物活性和热稳定性得以改善。目的物的生物活性测定目的物的生物活性测定 体外生物活性测定方法有靶细胞培养计数法、3H-TaR掺入法和酶法细胞计数等。体内生物活性测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型。第四节第四节 目的产物的保存目的产物的保存液态保存液态保存低温保存: 液态蛋白质样品在-1020以下冷冻保存比较理想。2. 在稳定PH条件下保存： 蛋白质较稳定的PH一般在等电点。保存液态蛋白质样品时，应小心调整到其稳定的PH范围内。3. 在高浓度下保存： 一般蛋白质在浓溶液中比较稳定。4. 在保护