miRNA是一种小RNA分子参考模板

1、RNA干扰及其应用摘要 RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(Double strands RNA，dsRNA)与细胞内的同源序列mRNA相结合并使之降解的现象，是一种序列特异的基因沉默，其作用相当于基因敲除，导致相应基因的表型缺失。本文只要介绍了RNAi的产生背景、研究历史、作用机制、现状、未来发展趋势、实践或理论意义。关键词 RNA干扰 RNAi 基因沉默RNAi产生背景与研究历史：早在1984年，Izomt等研究小鼠L细胞时发现反义mRNA会干扰与之同源的基因表达。1990年，Jorgensen等将紫色素合成基因导入牵牛花中，发现不但导

2、入的基因没有表达，植物本身的色素合成基因也受到某种程度的抑制，这种现象被称为协同抑制(Cosuppression)。Cogoni等将albino一3基因导入链孢霉(Neurospora crassa)中，发现了与Jorgensen类似的结果，其内源性基因表达减弱，这种现象被称为消除作用(Quellillg)。当时形成的理论是DNA甲基化或RNA中间体介导的应答。直到1995年，康奈尔大学的Guo等在用反义RNA技术阻断秀丽线虫中par一1基因的表达时，意外地发现无论反义还是正义RNA都能阻断基因表达，但当时无法解释这一现象1。1998年，华盛顿卡耐基研究所的Fire和马萨诸塞州大学的Mello

3、通过将体外转录得到的单链RNA(正义RNA或反义RNA)及双链RNA分别纯化后注射给秀丽线虫，结果发现这种双链RNA比单独的正义RNA或反义RNA具有更高效的特异性基因沉默效应，且几个dsRNA分子就可以实现整个同源基因的完全沉默，这种现象在子代中也能持续存在。人们将这种现象称作RNAi2,它广泛存在于生物界，是生物体抵御病毒或其他外来核酸入侵而保持自身遗传稳定的保护性机制。目前在果蝇、真菌、昆虫、植物以及哺乳动物中均发现了RNAi现象，由于其高效率、高特异性等特点，一些科学家已将其以基因治疗的方式应用于一些重大传染病的治疗，如HIV和HBV。同时，由于RNAi具有等效于基因敲除的功能，所以作

4、为反向遗传学的工具也被广泛应用于基因功能的研究和新基因的发现3。RNAi的作用机制尽管不同物种RNAi的作用机制存在差异，但是都要经过相似的两个保守的生物学过程： 起始阶段：不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，与Dicer(dsRNAspecific endonuclease，Dicer)的c末端结构域结合后，被切割产生2123nt的siRNA(Small interfering RNA)片断，其结构特征为具有5单磷酸和3羟基末端，互补双链的羟基端均有一个23nt的单链突出，此过程需要ATP供能； 效应阶段：Dicer通过PAZ结构域与含有PAZ结构域的Arg

5、onaute蛋白，核酸内、外切酶，解旋酶及siRNA一起形成具有多个亚单元的核糖核苷酸蛋白复合物(RNA inducing silencing complex，RISC)，插入siRNA后RISC被激活，在ATP供能的条件下解旋酶解开siRNA双链，使其反义链互补并结合到靶向mRNA上与之相匹配的特异序列，RISC中的核酸内切酶切断mRNA，mRNA残基随后迅速地被细胞内的RNA外切酶所降解，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。此外，在植物和线虫中还存在信号放大过程：解开siRNA的双链后，反义RNA链能作为双链RNA合成的一个引物，以mRNA为模板，在RISC中的RNA依赖的RNA聚合酶(

6、RNA dependent RNA polymerases，RdRPs，又称作RDRs)的作用下形成新的dsRNA，并再次被Dicer识别并切断后形成新的1 / 3siRNA，再循环作用于另外的靶向mRNA。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA，使RNAi在短时间内迅速有效地抑制mRNA翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地抑制靶向基因蛋白质或多肽的合成4。但是在哺乳动物中不存在这种现象，可能与在哺乳动物体中siRNA不能作为RdRPs的引物有关5。除上述转录后基因沉默外，RNAi还可以诱导转录水平的基因沉默。通过诱导DNA甲基化、异染色质化等造成基因不能正常表达，通过抑制重复序列的转录产

7、物，RNAi引导异染色质形成，阻碍有可能换位的成分和其他外源性DNA整合到宿主基因组，这是外源基因插入后生物体的一种自我保护机制。这种现象在植物中得到证实，但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等6研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。然而，Morris等7,8也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。参考文献1Guo S，Kemphens KJParla gene required for establi

8、shing polarity in Celegans embryos，encodes a putative SerTh kinase that is asymmetrically distributedJCell，1995，81(4)：6116202王铁君，王红勇，陈玉丙等RNAi的肿瘤基因治疗J现代肿瘤医学，2009，17(10)：1801833陈煜，谢小芳RNAi的作用机制及抗病毒研究进展J世界华人消化杂志2006，14(21)：212321294 Brummelkamp T R，Bernards R，Agami RA system for stable expression of sho

9、fl interfering RNAs in mammalian cellsJScience，2002，296(5567)：5505535deW it T，Grosveld F，Drabek DThe tomato RNADirected RNA polymerase has no efect on gene silencing by RNA interference in transgenic miceJTransgenic Res，2002，1 1(3)：3053106 Svoboda P，Stein P，Filipowiez W ，el a1Lack of homologous sequ

10、ence specific DNA methylation in response to stable dsRNA expression in mouse oocytesJNucleic Acids Res，2004，32(12)：360136067 Morris K V，Chan S W ，Jacobsen S E，et a1Small interfering RNAinduced transcriptional gene silencing in human cellsJScience，2004，305(5688)：128912928 Kawasaki H ，Taira KInduction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cellsJNature，2004，431(7005)：2112179 Lee C J，Suh E J，Kang H T，et a1Induction of senescen