细胞生物学实验课

1、细胞生物学实验课目目 录录1. 掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作。除菌法的操作。2. 了解化学消毒法的使用方法。了解化学消毒法的使用方法。3. 了解传代细胞的传代方法及操作过程，了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长学习观察体外培养细胞的形态及生长状况及细胞增殖动力学测定的方法。状况及细胞增殖动力学测定的方法。显微镜下的培养细胞显微镜下的培养细胞1、玻璃器材的清洗处理方法、玻璃器材的清洗处理方法2、塑料器材的清洗处理方法、塑料器材的清洗处理方法3、橡皮器材的清洗处理方法、橡皮器材的清洗处理方法4、金属器材的清洗处理方法、金

2、属器材的清洗处理方法5、细胞的消化传代方法、细胞的消化传代方法方法方法1、玻璃器材的清洗处理方法、玻璃器材的清洗处理方法清洁液浸泡或用清洁液浸泡或用2%磷酸三钠或洁消精浸泡过夜磷酸三钠或洁消精浸泡过夜自来水冲自来水冲10次次培养瓶再用三蒸水浸泡过夜培养瓶再用三蒸水浸泡过夜晾干晾干包装包装灭菌灭菌单蒸水洗单蒸水洗2次次晾干备用晾干备用备用备用刷洗刷洗浸泡浸泡2、塑料器材的清洗处理方法、塑料器材的清洗处理方法用用3%HCl或或2%NaOH溶液浸泡过夜溶液浸泡过夜（单用或交叉处理）（单用或交叉处理）水洗水洗10次次单蒸水单蒸水2次次紫外线或辐射灭菌备用紫外线或辐射灭菌备用三蒸水浸泡过夜三蒸水浸泡过夜

3、晾干晾干刷洗刷洗浸泡浸泡3、橡皮器材的清洗处理方法、橡皮器材的清洗处理方法5%NaOH煮煮10 20水洗水洗4%盐酸煮盐酸煮10 20单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用水洗水洗810次次刷洗刷洗浸泡浸泡金属器材的清洗处理方法金属器材的清洗处理方法纸擦去表面的油脂纸擦去表面的油脂洗衣粉煮沸或用洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠煮沸碳酸氢钠煮沸15分钟分钟水洗水洗95%酒精纱布擦干酒精纱布擦干包装灭菌包装灭菌4、金属器材的清洗处理方法、金属器材的清洗处理方法吸除或倒掉旧培养液吸除或倒掉旧培养液加入加入2mL，无钙、镁，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉，漂洗一次后倒掉加入加入

4、1mL消化液（消化液（0.25%胰蛋白酶或胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）或混合液）肉眼可观察到肉眼可观察到“薄膜薄膜”现象时，倒掉消化液现象时，倒掉消化液继续作用继续作用23分钟分钟显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化消化5、细胞的消化传代方法、细胞的消化传代方法加入完全培养基加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打，用吸管反复吹打计数板计数计数板计数分瓶培养分瓶培养细胞的消化传代方法细胞的消化传代方法生长细胞形态生长细胞形态1简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。2细胞培

5、养获得成功的关键要素是什么细胞培养获得成功的关键要素是什么?3简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。4绘制细胞生长曲线图。绘制细胞生长曲线图。5绘制细胞分裂指数图。绘制细胞分裂指数图。 通过细胞融合技术，初步了解染色体通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。三种时相的提前凝集染色体特点。 1、细胞融合方法、细胞融合方法 2、PCC诱导和观察诱导和观察 收集收集1瓶瓶M期细胞、消化一瓶贴壁细胞混合离心期细胞、消化一瓶贴壁细胞混合离心用用Hanks液洗液洗1次次离

6、心弃上清（吸干）轻弹使细胞分散离心弃上清（吸干）轻弹使细胞分散90s后后1、细胞融合方法、细胞融合方法 377滴加滴加5050PEG0.5mlPEG0.5ml（1212滴）滴）加入加入2ml 1640（含（含10血清）血清）加一滴秋水仙素（加一滴秋水仙素（10gml ）分别在分别在5min、15min、20min观察细胞融合观察细胞融合加入加入5ml1640洗一次（不要吹打）离心洗一次（不要吹打）离心细胞融合细胞融合90分钟后离心弃上清分钟后离心弃上清加入加入0.075mol/lKCl8ml混匀混匀372525分钟分钟加入加入1ml固定液混匀离心弃上清固定液混匀离心弃上清2、PCC诱导和观察诱

7、导和观察 加加7ml固定液固定固定液固定20min离心弃上清加离心弃上清加0.5ml固定液固定液滴片（冰、高、烤）滴片（冰、高、烤）Giemsa染色染色12min水冲、晾干、镜检水冲、晾干、镜检1. 根据根据PCC图像的观察，试说明对于理图像的观察，试说明对于理解细胞周期和解细胞周期和DNA复制有什么启示复制有什么启示?2. 简述细胞融合的原理。简述细胞融合的原理。3. PCC实验的主要意义是什么？实验的主要意义是什么？1.1.掌握常用饲养层的制备原理和方法。掌握常用饲养层的制备原理和方法。2.2.巩固细胞培养相关的的技术。巩固细胞培养相关的的技术。 将原代培养的将原代培养的MEF细胞进行传代

8、，多为细胞进行传代，多为36代，这样不仅可以使得代，这样不仅可以使得MEF细胞的纯度较高，细胞的纯度较高，而且生长状态也很好。在制备饲养层前将而且生长状态也很好。在制备饲养层前将MEF细胞用丝裂霉素细胞用丝裂霉素C或射线照射预处理，或射线照射预处理，抑制抑制DNA的复制使其在保持分泌功能的基础的复制使其在保持分泌功能的基础上失去增值能力，以免与上失去增值能力，以免与ES的生长发生竞争。的生长发生竞争。 在具体实验中，在具体实验中，MEF细胞的原代分离时胎龄的选择，作为饲细胞的原代分离时胎龄的选择，作为饲养层使用时细胞代数的选择，丝裂霉素处理的浓度都会影响养层使用时细胞代数的选择，丝裂霉素处理的

9、浓度都会影响饲养层培养体系的质量。饲养层培养体系的质量。 胎龄过大，则成纤维细胞的成分降低，分离效率低下，且胎龄过大，则成纤维细胞的成分降低，分离效率低下，且易混杂其他细胞，难以去处。若胎龄过小，胚胎形态小，易混杂其他细胞，难以去处。若胎龄过小，胚胎形态小，躯干部分不易分辩，操作困难。躯干部分不易分辩，操作困难。 细胞代数过多，则出现衰老征象；细胞代数过少，不容易纯化。细胞代数过多，则出现衰老征象；细胞代数过少，不容易纯化。 丝裂霉素的浓度处理和处理时间直接影响细胞的状态。丝裂霉素的浓度处理和处理时间直接影响细胞的状态。小鼠胚胎成纤维细胞显小鼠胚胎成纤维细胞显微图微图体外培养的小鼠胚胎成纤维体

10、外培养的小鼠胚胎成纤维细胞细胞 无菌操作无菌操作 吹打细胞时要小心，用力均匀吹打细胞时要小心，用力均匀 用酶消化时注意时间，不可过渡用酶消化时注意时间，不可过渡1.1.细胞计数，绘制细胞计数，绘制MEFMEF细胞生长曲线，连续细胞生长曲线，连续7 7天，至少天，至少5 5天。分三个处理天。分三个处理20mg/L20mg/L和和10 mg/L10 mg/L以及空白组以及空白组2.2.做好原代培养工作，并在做好原代培养工作，并在4848小时换液时和小时换液时和4-54-5天传天传代时，仔细观察细胞形态和生长状态并记录结果，代时，仔细观察细胞形态和生长状态并记录结果，分析产生结果的原因。分析产生结果

11、的原因。3.3.设计细胞培养室的理想布局，并且将仪器配备入内。设计细胞培养室的理想布局，并且将仪器配备入内。4.4.掌握细胞培养过程中的常用方法。掌握细胞培养过程中的常用方法。5. 如何尽可能的做到无菌操作如何尽可能的做到无菌操作 通过掌握通过掌握MS培养基母液配制及常用培养基母液配制及常用培养基的制备和灭菌方法，为植物组织培养基的制备和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件；掌握植物外培养准备合适的营养条件；掌握植物外植体的消毒技术、离体培养的无菌操作植体的消毒技术、离体培养的无菌操作和愈伤组织诱导技术。和愈伤组织诱导技术。 植物材料培养要获得成功，并正常植物材料培养要获得成功，并正常生

12、长，培养基的成分是一个决定性因素，生长，培养基的成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基。不同植物要求不同的培养基。 大多数植物组织培养所用的培养基由无大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。和有机附加物等五类物质组成。 由于细胞的全能性，在合适的生长由于细胞的全能性，在合适的生长条件下，一定浓度的细胞分裂素和生长条件下，一定浓度的细胞分裂素和生长素配比可以诱导植物的外植体脱分化产素配比可以诱导植物的外植体脱分化产生愈伤组织，为进一步再分化创造条件。生愈伤组织，为进一步再分化创造条件。 高压灭菌

13、锅、普通及精密天平、高压灭菌锅、普通及精密天平、玻璃器皿（烧杯、玻璃器皿（烧杯、10001000、500mL500mL容量容量瓶、移液管、试剂瓶、瓶、移液管、试剂瓶、10001000、500500、100 mL 100 mL 三角瓶）、化学试剂。三角瓶）、化学试剂。 1、配制几种母液、配制几种母液（1）配制）配制100倍倍1L MS大量元素母液大量元素母液NHNH4 4NONO3 3 165g KHKH3POPO4 4 17gKNOKNO3 3 190g CaCl CaCl2 22H2H2 2OO 44gMgSOMgSO4 47H7H2 2OO 37g （2）配制）配制MS微量元素母液微量元素

14、母液 配制成配制成100倍倍1L母液，母液。依次称取母液，母液。依次称取KI KI 0.083g Na Na2MoOMoO42H2H2O O 0.025gH H3BOBO3 0.62g CuSO CuSO45H5H2O O 0.0025gMnSOMnSO4HH2O O 1.69g CoCl CoCl26H6H2O O 0.0025gZnSOZnSO47H7H2OO0.86g （3）配制）配制MS有机母液有机母液一般配制成一般配制成100倍倍1L MS有机母液。依次称取有机母液。依次称取肌醇肌醇 10.0g 盐酸硫胺素盐酸硫胺素 0.01g烟酸烟酸 0.05g 甘氨酸甘氨酸 0.20g盐酸吡哆醇

15、盐酸吡哆醇 0.05g （4）配制）配制MS铁盐母液铁盐母液一般配制成一般配制成100倍倍lL MS铁盐母液。依次称取铁盐母液。依次称取EDTAEDTA二钠二钠 3.73g FeSO FeSO4 47H7H2O O 2.78g 2植物激素的配制植物激素的配制 0.1mg/mL 的的6-BA溶液：取溶液：取25mg的的6-BA，用，用少量少量1N的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至250mL。0.1mg/mL NAA：取：取25mg的的NAA可溶于热水中或可溶于热水中或用少量用少量95%乙醇或少量乙醇或少量1N的的NOH溶解后，再加溶解后，再加水定容至水定容至250mL。 3

16、培养基的配制培养基的配制 分别吸取母液各分别吸取母液各10mL及及6-BA 和和NAA 母母液各液各20mL，混合后，再加蔗糖至终浓度，混合后，再加蔗糖至终浓度3%，用用NaOH调节调节pH至至6.0；加入琼脂；加入琼脂6g。最后加。最后加蒸馏水定容至于蒸馏水定容至于1L。然后用组织培养用封口膜。然后用组织培养用封口膜封上，扎紧后灭菌封上，扎紧后灭菌 。 4培养基灭菌和分装培养基灭菌和分装 将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待压力上升到压力上升到0.5kg/cm2时，排净冷空气，关闭放气时，排净冷空气，关闭放气阀继续加热使压力稳定在阀继续加热使压

17、力稳定在1.2kg/cm2，温度为，温度为121的条件下，维持的条件下，维持1520分钟。灭菌后的培养基分钟。灭菌后的培养基冷却至冷却至65左右，分装，每左右，分装，每100mL三角瓶装三角瓶装40mL，共装共装25瓶。瓶。 5消毒液的配制消毒液的配制次氯酸纳消毒液：取次氯酸纳消毒液：取30mL次氯酸纳溶液，用蒸次氯酸纳溶液，用蒸馏水定容至馏水定容至100mL。现配现用。现配现用。75%的酒精：的酒精：75mL的的95%的酒精加水定容至的酒精加水定容至95mL。 6外植体的制备和接种外植体的制备和接种 将发芽的零余子用次氯酸纳消毒液或者将发芽的零余子用次氯酸纳消毒液或者75%的酒精消毒后移入超

18、净工作台的无菌培养皿中，的酒精消毒后移入超净工作台的无菌培养皿中，用解剖刀切取苗芽，然后将其接种在培养基上，用解剖刀切取苗芽，然后将其接种在培养基上，一般每瓶接种一般每瓶接种4-5片苗芽。快速封好瓶口，并写片苗芽。快速封好瓶口，并写上接种日期。上接种日期。 7愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 接种后的三角瓶置于接种后的三角瓶置于24条件下，黑条件下，黑暗培养一周，然后在同样温度下分为光照暗培养一周，然后在同样温度下分为光照和黑暗培养直至愈伤组织形成。和黑暗培养直至愈伤组织形成。 配制铁盐母液时，配制铁盐母液时，FeS04和和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，应分别加热溶解后混合， 并置于加热搅拌

19、并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热约加热20 - 30 min)，调，调pH值至值至5.5，防止，防止FeS04结晶结晶析出。析出。 因为高温灭菌会降低因为高温灭菌会降低pH值（约值（约0.2-0.3个个pH值），配制时常提高值），配制时常提高pH值值0.2-0.3。 接种时严格注意无菌操作。接种时严格注意无菌操作。1 1植物培养基为什么要分成母液分开配制。植物培养基为什么要分成母液分开配制。2. 2. 分析实验中植物愈伤组织生长所需要的必分析实验中植物愈伤组织生长所需要的必要条件。要条件。1.1.学习植物细胞原生质体分离和纯化的学习植物细胞原生质体分离和纯化的方法。方法。 2.2.了解原生质体活性鉴定的原理。了解原生质体活性鉴定的原理。由于原生质体内由于原生质体内 部与外界环境之间仅隔一层薄部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。能保持其完整性。 其次其次,还应当考虑取材、酶的还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。因素对分离原生质体的影响。