PPR蛋白模块化识别单链RNA的结构基础翻译参考模板

1、PPR蛋白模块化识别单链RNA的结构基础PPR蛋白（Pentatricopeptide repeat）是广泛分布于各类生物中的一大类蛋白家族。是一种序列特异性的RNA结合蛋白，涉及到RNA生命代谢活动的多个方面。PPR蛋白陆生开花植物的线粒体和叶绿体中的含量非常的丰富，它是以一种模块化的方式识别单链的RNA（ssRNA）。拟南芥叶绿体中的的PPR10蛋白结合分别来自基因ATPI-ATPH和PSAJ-RPL33编码的相似的RNA序列，分别被称为ATPH和PSAJ。通过保护靶标RNA元件免受3和5核酸外切酶的作用，PPR10能识别相应的信使RNA 3和5末端。尽管识别机制特点，但其识别机理及识别密

2、码尚不明确有待于进一步的阐明。在这里我们报道了PPR10蛋白不结合RNA和结合RNA的分子晶体结构，它们的分辨率分别是2.85艾米和 2.45艾米。在不结合RNA时，19个重复片段构成一个右手“超螺线”螺旋。两个PPR10蛋白的单体反平行排列，相互缠绕组成一个二聚体，已经结合在目标RNA（18个核苷酸的PSAJ）分子上，就展现出相当大的构型的变化。PSAJ有六个核苷酸被PPR10蛋白的六个相应的重复序列特异性的识别按照预测的识别密码。特异性的分子基础和RNA的A,G,U碱基的分子识别被揭示了。PPR蛋白识别RNA的结构基础的阐明为PPR蛋白潜在的生物技术上的应用提供了一个基础，在RNA相关研究

3、领域。PPR蛋白涉及到RNA生命代谢活动的多个方面，例如RNA的转录、剪切、编辑、和降解，翻译等过程。在植物中PPR蛋白的突变可能导致胚胎的致死性 ，一些 PPR蛋白扮演者雄性不用的修复者的角色。在人类当中线粒体PPR蛋白LRPPRC的突变是与加拿大法语社区的人的Leigh syndrome相关的，这种病的特征是复合体IV的缺陷。PPR蛋白包含2-30个串联的重复片段，每个重复包含35个氨基酸，这35个氨基酸组成一个螺旋发卡结构。PPR蛋白分为两个系列：P系列，它的每一个重复都含有35个氨基酸;PLS系列，每个重复含有3136个氨基酸不等和额外的碳末端。计算机和生物信息学的分析表明PPR蛋白是

4、以一种模块化的方式识别RNA的，但是这种方式不同于RNA结合结构域的结合方式。由生物信息学和生物化学的分析而推测的PPR蛋白识别RNA的识别密码有待于晶体结构的确认。为了阐明PPR蛋白特异性识别RNA的机制，我们寻求确定结合了相应的靶RNA的PPR蛋白复合物的晶体结构。这种重组的拟南芥的叶绿体的PPR10蛋白，属于P系列能特异性的结合17个核苷酸的ATPH和18个核苷酸的PSAJ(Extended Data Fig. 1a)。我们进行了一系列的努力来确定非结合RNA和结合RNA的PPR10的晶体结构。包含有4重半胱氨酸突变(C256S/C279S/C430S/C449S)的非结合RNA的PPR

5、10蛋白片段（resident61-786)的晶体结构被确定在2.85艾米的精度.PPR10蛋白形成一个两圈的右手超螺旋的装配结构,包含有19个PPR蛋白结构域，它的氨基端是三个短的螺旋（NTD），碳末端是单一的螺旋（Fig.1a)。重复序列蛋白的端部结构域是与配体的特异性结合相关的例如;TPR和TALE。PPR10蛋白的额外结构域的功能有待于确定。每一个PPR蛋白结构域的35个氨基酸组成一个螺旋发卡结构。每个螺旋包含四圈，伴随有一个5个氨基酸的loop结构相连（Fig.1b)。这两个螺旋，分别被命名为helix a和helix b,这两个螺旋有一个两个氨基酸的turn相连，每个重复的heli

6、x a和helix b分别构成这个超螺旋组装结构的内层和外层（Fig.1a)。在晶体结构中PPR10的单个分子是非对称的结构，然而两个非对称的PPR10蛋白相互缠绕组成一个反平行的模式。一个分子的N端和另一个分子的C端相互靠近。然而这个椭圆体的极性轴的长度140艾米，径长70艾米。2 / 5在PPR10蛋白结构的基础上，我们定义在PPR motif的helix的第一个氨基酸残基为开始氨基酸(Fig.1bandExtendedData Fig. 1b)。相比于以前所定义的边界范围，这种定义开始氨基酸的方法导致PPR motif一个残基的前移或后移(Extended Data Fig. 1c)。基

7、于这种新的PPR motif的边界定义，所预测的决定RNA结合特异性的残基都在结构上包含在一个起作用的motif上。我们希望这种基于结构基础的PPR motif边界划分未来能够简化对PPR蛋白的描述。经历了无数的不成功的PPR10-ATPH结晶实验后，我们最终确定了在结合有18个核苷酸的PSAJRNA的PPR10（risidues37-786,C256S/C279S/C430S/C449S）的晶体结构,分辨率为2.45艾米(Extended Data Table1).在晶体结构中在每一个非对称的单元中，都是一个反平行的PPR10二聚体。通过分析结合有PASJ的PPR10的超速离心沉降平衡平衡实

8、验，实验支持在毫摩尔的浓度下PPR10蛋白为二聚体存在的性质（Extend Date Fig.2）.PPR10原体可以叠加为一个平角方差为1.3艾米的629个碳原子的一个蛋白结构图（Extend Date Fig2）。二聚体的整体外观变成了一个空心的圆筒状的管状结构（Fig.2a）,PPR10蛋白原体的N-末端和C-末端部分被压进空心圆筒的中间，这导致了管状结构的轴向长度减少了20艾米的长度（Fig.2b）.PPR10蛋白的许多氨基酸填充在一张电子密度图中，电子密度图表明RNA碱基在圆柱形管的两端是清晰可见的。两个被结合的RNA元件的18和14个核苷酸的电子密度分布图是由Br的异常信号来确定的

9、。这种信号时从结合有Br标记的RNA寡核苷酸的PPR10蛋白的晶体结构收集得到的。ssRNA的5端和3端部分分别由一个PPR10蛋白体的N末端重复部分和另一个PPR10蛋白原体的C末端特异性的结合。通过对比分析得知ssRNA的中间部分，包括U5和A11两个核苷酸不与PPR10蛋白表现出相互协调作用的现象。PPR10有19个重复部分，PSAJRNA包含有18个核苷酸。PSAJRNA的特异性识别开始于repeat3这是与在生物信息学分析上的预测相一致的（Fig.3a）。在每个PSAJRNA的5末端的前四个核苷酸（5 -GUAU-3 ）中的每一个碱基都被4个氨基酸所包围，这包括两个相邻的重复片段的第

10、二位碱基和分别来自这两个相应的氨基酸片段的第五位和第35个残基，除了这种碱基识别，所结合的PSAJRNA的磷酸骨架和核糖基团，也可以与带电荷的或极性的氨基酸相互协调作用（Extend Date Fig.5c）。在每一个重复部分的位于第5位的极性氨基酸对RNA碱基的特异性结合表现出非常重要的决定性作用，分别位于repeat3-6的Thr 178,Asn 213, Ser 249 and Asn 284分别通过氢键相互作用特异性的识别碱基G1,U2, A3 and U4。第5位氨基酸残基的重要性是通过突变分析实验而得到的，在repeats 4(N213A), 5 (S249L) or 6 (N28

11、4A)的第5位残基中的任何一个的突变都会结合RNA特性的消失。相比较repeats7, 8, 10, 11 和 13的第5位残基的替换，这些残基是在结构上不涉及到RNA特异性结合的残基，所以对于PSAJ大的结合显示出很小或没有影响（Extend Date Fig.6）。氢键都是受到外环境的护壁遮掩。PPR10蛋白repeats3-7的第二位上的5个氨基酸残基主要通过范德华相互作用夹持着4个碱基(Fig.3a).例如，G1碱基由Arg 175/Val 210，这两个氨基酸分别位于repeat3和repeat4。同样U2,A3，U4分别由Val 210/Phe 246, Phe 246/Val 2

12、81 and Val 281/Val 316夹持着。第35位的残基也位于上述的残基的附近位置，这有可能是水分子介导极性残基与碱基之间的氢键，尽管在晶体结构中看不见。值得重要一提的是Asp244和Asp314，这两个氨基酸分别是repeat3和6的第35位氨基酸。Asp244和Asp314分别通过氢键结合在Asn213和Asn284上，这两个氨基酸分别为相应的repeats的第5位上的氨基酸，这种相互作用有助于稳定PPR10的碱基识别构想(Fig. 3b and Extended Data Fig. 6d)。由另一个PPR10原体的C末端的重复序列对PSAJRNA的3末端的识别没有表现出明显的模块化的模式，除了U15和U16两个，这两个碱基由repeat16和repeat17来发生相互协调作用，按照上述的识别U2和U4的模式进行的。碱基A11和碱基C18是以一种非模块识别的方式发生相