第二章微生物药物生物合成及调控第二节发酵工艺学夏焕章第三

1、第二章微生物药物生物合成第二章微生物药物生物合成及调控第二节发酵工艺学夏及调控第二节发酵工艺学夏焕章第三焕章第三学习目标 熟悉微生物次级代谢产物的特点和次级代谢产物生物合成的控制。v掌握微生物次级代谢产物的生物合成过程及其调掌握微生物次级代谢产物的生物合成过程及其调节机制。节机制。v了解微生物药物的生物合成及其调节机制的指导了解微生物药物的生物合成及其调节机制的指导意义。意义。 前言v各种代谢反应和代谢途径错综复杂：各种代谢反应和代谢途径错综复杂： 代谢网络（代谢网络（metabolic network） 多代谢作用（多代谢作用（pleometabolism） 代谢栅栏（代谢栅栏（metabo

2、lic grid）v生物合成既涉及初级代谢又涉及次级代谢生物合成既涉及初级代谢又涉及次级代谢v微生物药物（这里指微生物次级代谢产物）的合微生物药物（这里指微生物次级代谢产物）的合成是在微生物体内酶催化下将小分子物质逐步合成是在微生物体内酶催化下将小分子物质逐步合成分子量较大产物的生化反应过程。成分子量较大产物的生化反应过程。 生物合成过程中，严格地受到微生物细胞内存在的代谢调节，以及外界环境条件的调节。v人们利用已知或可能存在的生物合成途径及其代人们利用已知或可能存在的生物合成途径及其代谢调控理论，已成功地解决了微生物药物生产过谢调控理论，已成功地解决了微生物药物生产过程中菌种产量、发酵工艺、

3、产品质量等关键问题程中菌种产量、发酵工艺、产品质量等关键问题。v微生物药物的生物合成及其调控理论在微生物药微生物药物的生物合成及其调控理论在微生物药物的生产中起着非常重要的指导作用。物的生产中起着非常重要的指导作用。学习内容第一节 微生物代谢调节（3学时）第二节 次级代谢与次级代谢产物（1学时）第三节 次级代谢产物的生物合成（2学时）第四节 次级代谢产物生物合成的调节与控制（2学时）第二节 次级代谢与次级代谢产物微生物的代谢微生物的代谢初级代谢初级代谢次级代谢次级代谢微生物的代谢产物微生物的代谢产物初级代谢产物初级代谢产物次级代谢产物次级代谢产物指与微生物的生长繁殖有指与微生物的生长繁殖有密切

4、关系的代谢活动。密切关系的代谢活动。指与微生物的生长繁殖无指与微生物的生长繁殖无明显相关功能的代谢活动。明显相关功能的代谢活动。初级代谢产物特征初级代谢产物特征 它们是菌体生长繁殖所必须的物质它们是菌体生长繁殖所必须的物质 是各种微生物所共有的产物是各种微生物所共有的产物 存在着严格的代谢调控系统存在着严格的代谢调控系统初级代谢产物（初级代谢产物（Primary metabolites） 指与微生物的生长繁殖有密切关系的代谢产物。如指与微生物的生长繁殖有密切关系的代谢产物。如氨基酸，蛋白质，核酸，核苷酸，维生素，脂肪酸等。氨基酸，蛋白质，核酸，核苷酸，维生素，脂肪酸等。次级代谢产物特征次级代谢

5、产物特征 特定菌种产生的代谢产物特定菌种产生的代谢产物 菌体特定生长阶段的产物菌体特定生长阶段的产物 多组分的混合物多组分的混合物 多基因控制等多基因控制等次级代谢产物（次级代谢产物（Secondary metabolites） 指与微生物的生长繁殖无关的代谢产物。如抗生素，指与微生物的生长繁殖无关的代谢产物。如抗生素，色素，生物碱，毒素等。色素，生物碱，毒素等。一、次级代谢产物类型一、次级代谢产物类型根据产物的作用分类：根据产物的作用分类：根据产物的主要成分及其与初级代谢的关系分类：根据产物的主要成分及其与初级代谢的关系分类：抗生素、激素、维生素、毒素、生物碱、色素抗生素、激素、维生素、毒素

6、、生物碱、色素糖类、多肽类、聚酯酰类、糖类、多肽类、聚酯酰类、核酸碱基类似物、灵菌红素等其他类型核酸碱基类似物、灵菌红素等其他类型二、次级代谢（产物）的特点二、次级代谢（产物）的特点 特定菌种产生的代谢产物特定菌种产生的代谢产物 菌体特定生长阶段的产物菌体特定生长阶段的产物 多组分的混合物多组分的混合物 以初级代谢产物为前体或起始物进行合成以初级代谢产物为前体或起始物进行合成 次级代谢产物的生物合成受初级代谢的调节次级代谢产物的生物合成受初级代谢的调节 次级代谢产物结构多样、特殊次级代谢产物结构多样、特殊 次级代谢酶在细胞中具有特定的位置和结构次级代谢酶在细胞中具有特定的位置和结构 次级代谢产

7、物的合成过程中的基因控制次级代谢产物的合成过程中的基因控制 次级代谢产物的合成对环境因素特别敏感次级代谢产物的合成对环境因素特别敏感 次级代谢产物的合成与菌体的形态变化有一定的关联次级代谢产物的合成与菌体的形态变化有一定的关联（一）特定菌种产生的代谢产物（一）特定菌种产生的代谢产物土壤微生物土壤微生物 放线菌（链霉菌属，稀有放线菌）放线菌（链霉菌属，稀有放线菌） 丝状真菌（不完全菌纲，担子菌纲）丝状真菌（不完全菌纲，担子菌纲） 产孢子的细菌产孢子的细菌开发海洋微生物寻找结构新颖的次级代谢产物开发海洋微生物寻找结构新颖的次级代谢产物微生物次级代谢产物Penicillium chrysogenum

8、（产黄青霉）Penicillin（青霉素） Streptomyces griseus（灰色链霉菌） Streptomycin（链霉素）Streptomyces avermitilis（阿维链霉菌）Avermectins（阿维菌素） Streptomyces mycarofaciens（生米卡链霉菌）Midecamycin（麦迪霉素） Amycolatopsis orientalis（东方拟无枝酸菌）Vancomycin（万古霉素） 表表2-3 一些特定微生物产生的次级代谢产物一些特定微生物产生的次级代谢产物（二）菌体特定生长阶段的产物（二）菌体特定生长阶段的产物 菌体生长阶段：不产生或极少产生

9、菌体生长阶段：不产生或极少产生 产物合成阶段：大量产生产物合成阶段：大量产生 菌体衰亡（自溶）阶段：不产生菌体衰亡（自溶）阶段：不产生 菌体生长速率减慢；菌体生长速率减慢； 积累了相当数量的某些代谢中间体；积累了相当数量的某些代谢中间体； 与菌体生长有关的酶活力开始下降；与菌体生长有关的酶活力开始下降； 与次级代谢有关的酶开始出现；与次级代谢有关的酶开始出现； 菌体的生理状况发生改变，发酵就从菌体生长阶段转入菌体的生理状况发生改变，发酵就从菌体生长阶段转入 次级代谢产物合成阶段。次级代谢产物合成阶段。生理阶段的转变生理阶段的转变（三）多组分的混合物（三）多组分的混合物15个组分个组分Strep

10、tomyces tenebrarius（黑暗链霉菌（黑暗链霉菌 ) 8个组分个组分Streptomyces avermitilis Penicillium chrysogenum 6个组分个组分图图2-34 天然青霉素的结构和生物活性天然青霉素的结构和生物活性侧链取代基（R）俗名学名相对分子质量生物活性（U/mg钠盐）C6H5CH2青霉素G氨苄青霉素334.381667C6H5OCH2青霉素V苯氧甲基青霉素350.381595pHOC6H4CH2青霉素X对羟基苄青霉素350.38970C2H5CH=CHCH2青霉素F戊烯青霉素312.371625CH3(CH2)4双氢青霉素F戊青霉素314.4

11、01610CH3(CH2)6青霉素K庚青霉素342.352300Penicillium chrysogenum 产生的产生的6个组分，主要差异是侧链个组分，主要差异是侧链取代基（取代基（R）不同，见图）不同，见图2-34。举例举例图图2-35 阿维菌素各组分的结构阿维菌素各组分的结构举例举例Streptomyces avermitilis 能够产生能够产生8个组分，仅在个组分，仅在R1、R2和和X-Y基团的不同，见图基团的不同，见图2-35，其中，其中B1a为主组分。为主组分。次级代谢产物产生多组分的原因次级代谢产物产生多组分的原因 次级代谢产物的合成酶对底物要求的特异性不强（图次级代谢产物的

12、合成酶对底物要求的特异性不强（图2-36） 同一种底物可以被多种酶催化同一种底物可以被多种酶催化 次级代谢产物的合成酶对底物作用的不完全（图次级代谢产物的合成酶对底物作用的不完全（图2-37） 多代谢作用（多代谢作用（pleometabolism） 代谢网络（代谢网络（metabolic network） 代谢栅栏（代谢栅栏（metabolic grid）次级代谢过程次级代谢过程 青霉素生物合成中的青霉素生物合成中的，它可以，它可以将不同的酰基侧链转将不同的酰基侧链转移到青霉素母核移到青霉素母核6-APA的的7位氨基上，因位氨基上，因而天然青霉素发酵形而天然青霉素发酵形成了多种不同的组分，成了

13、多种不同的组分，青霉素青霉素G，V，O，F，X等。等。图图2-36 青霉素青霉素G的生物合成途径的生物合成途径酰基侧链酰基侧链酰基转移酶酰基转移酶异青霉素异青霉素N酰基水解酶酰基水解酶ACV合成酶合成酶异青霉素异青霉素N合成酶合成酶LLD-ACV三肽三肽6-青霉烷基氨酸（青霉烷基氨酸（6-APA）异青霉素异青霉素N青霉素青霉素G青霉素青霉素V+L-缬氨酸缬氨酸L-半胱氨酸半胱氨酸L-氨基己二酸氨基己二酸 CH2COOH CH2CONHNCOOHCH3CH3OS OCH2COOH OCH2CONHNOCOOHCH3CH3S青霉素青霉素G和青霉素和青霉素V生物合成机制生物合成机制苯氧乙酸苯氧乙酸青

14、霉素青霉素G青霉素青霉素V酰基转移酶酰基转移酶酰基转移酶酰基转移酶苯乙酸苯乙酸通过添加外源前体苯乙酸可提高青霉素通过添加外源前体苯乙酸可提高青霉素G的产量的产量通过添加外源前体苯氧乙酸可提高青霉素通过添加外源前体苯氧乙酸可提高青霉素V的产量的产量由于由于催化反应进行的不催化反应进行的不完全，使得完全，使得A，B组组分同时存在于发酵分同时存在于发酵产物中，因而形成产物中，因而形成了抗生素的多组分。了抗生素的多组分。图图2-37 阿维菌素的生物合成途径阿维菌素的生物合成途径甲氧基转移酶甲氧基转移酶5-酮基还原酶酮基还原酶糖基转移酶糖基转移酶例例 Penicillin合成的起始物合成的起始物: L-

15、 -氨基已二酸氨基已二酸 L-半胱氨酸半胱氨酸L-缬氨酸缬氨酸（四）以初级代谢产物为前体或起始物进行合成（四）以初级代谢产物为前体或起始物进行合成 次级代谢产物与初级代谢产物相对独立又相互联系，多数次级代谢产物与初级代谢产物相对独立又相互联系，多数次级代谢产物是以初级代谢产物为前体或起始物进行合成，次级代谢产物是以初级代谢产物为前体或起始物进行合成，见图见图2-38。图图2-38 次级代谢产物与初级代谢产物的关系次级代谢产物与初级代谢产物的关系乙酰辅酶乙酰辅酶A分枝酸分枝酸色、酪、苯丙色、酪、苯丙莽草酸莽草酸磷酸戊糖磷酸戊糖磷酸丁糖磷酸丁糖葡萄糖葡萄糖氨基糖氨基糖磷酸丙糖磷酸丙糖天冬氨酸天冬氨

16、酸丝氨酸丝氨酸半胱氨酸半胱氨酸甘氨酸甘氨酸杀假丝菌素杀假丝菌素利福霉素利福霉素氯霉素氯霉素氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素多肽类抗生素多肽类抗生素-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素红霉素红霉素四环素四环素利福霉素利福霉素灰黄霉素灰黄霉素阿维菌素阿维菌素核苷酸核苷酸核糖霉素核糖霉素庚酮糖庚酮糖磷酸甘油酸磷酸甘油酸丙酮酸丙酮酸缬氨酸缬氨酸蛋氨酸蛋氨酸赖氨酸赖氨酸苏氨酸苏氨酸异亮氨酸异亮氨酸琥珀酸琥珀酸草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸类异戊二烯类异戊二烯-酮戊二酸酮戊二酸聚酮体聚酮体赤霉素赤霉素类胡萝卜素类胡萝卜素胆固醇胆固醇脂肪酸脂肪酸表表2-4 初级代谢和次级代谢的分叉中间体初级代谢和次

17、级代谢的分叉中间体分叉中间体初级代谢产物次级代谢产物-氨基已二酸赖氨酸青霉素，头孢菌素C丙二酰-CoA脂肪酸大环内酯类抗生素，四环类抗生素，多烯大环内酯类抗生素，蒽环类抗生素莽草酸芳香族氨基酸氯霉素，杀假丝菌素，雷帕霉素戊糖核酸、核苷酸核苷类抗生素（嘌呤霉素）甲羟戊酸胆固醇、甾族化合物赤霉素，胡萝卜素 分叉中间体：在微生物的代谢过程中，存在一些中间代谢产物，既可以分叉中间体：在微生物的代谢过程中，存在一些中间代谢产物，既可以被微生物用来合成初级代谢产物，也可以被用来合成次级代谢产物，将这被微生物用来合成初级代谢产物，也可以被用来合成次级代谢产物，将这样的中间体称作分叉中间体。样的中间体称作分叉

18、中间体。 分叉中间体是调节两种代谢途径的枢纽，如果分叉中间体通向初级代谢分叉中间体是调节两种代谢途径的枢纽，如果分叉中间体通向初级代谢途径受到阻碍，次级代谢途径就会得到加强，反之，就会减弱。途径受到阻碍，次级代谢途径就会得到加强，反之，就会减弱。 初级代谢产物往往受到较为严格的代谢调控，为此也影响初级代谢产物往往受到较为严格的代谢调控，为此也影响到次级代谢产物的生物合成。到次级代谢产物的生物合成。 （五）次级代谢产物的生物合成受初级代谢的调节（五）次级代谢产物的生物合成受初级代谢的调节 初级代谢产物赖氨酸和缬氨酸初级代谢产物赖氨酸和缬氨酸对青霉素生物合成具有调控作用。对青霉素生物合成具有调控作

19、用。见图见图2-39和图和图2-40。举例举例6-APA反馈抑制反馈抑制反馈阻遏反馈阻遏青霉素青霉素G异青霉素异青霉素N赖氨酸赖氨酸-AAA-Cys-Val（ACV三肽）三肽）酵母氨酸酵母氨酸-氨基己二酸氨基己二酸-酮己二酸酮己二酸草酰戊二酸草酰戊二酸高异柠檬酸高异柠檬酸高柠檬酸高柠檬酸高柠檬酸合成酶高柠檬酸合成酶-酮戊二酸酮戊二酸乙酰辅酶乙酰辅酶A+图图2-39 赖氨酸对青霉素生物赖氨酸对青霉素生物合成的调节作用合成的调节作用图图2-39，代谢从，代谢从-氨基己二酸开氨基己二酸开始出现分支，一个方向合成赖氨酸，始出现分支，一个方向合成赖氨酸，一个方向合成青霉素一个方向合成青霉素G，赖氨酸和，

20、赖氨酸和青霉素青霉素G共同合成途径的第一个酶共同合成途径的第一个酶受赖氨酸的反馈抑制和反馈阻遏，受赖氨酸的反馈抑制和反馈阻遏，抑制作用的结果使抑制作用的结果使-氨基己二酸合氨基己二酸合成速率减慢，合成量减少，影响青成速率减慢，合成量减少，影响青霉素霉素G的生物合成，降低青霉素的生物合成，降低青霉素G产量。产量。图图2-40 缬氨酸的生物合成缬氨酸的生物合成 缬氨酸是合成青霉素缬氨酸是合成青霉素G的前的前体物，但它对自身合成途径的体物，但它对自身合成途径的第一个酶有反馈抑制作用，缬第一个酶有反馈抑制作用，缬氨酸不会过量积累，影响青霉氨酸不会过量积累，影响青霉素素G的生物合成，降低青霉素的生物合成

21、，降低青霉素G产量。产量。-乙酸乙酸-羟丙酸羟丙酸丙酮酸丙酮酸葡萄糖葡萄糖Thpp乙醇乙醇-Thpp反馈抑制反馈抑制乙酰羟酸合成酶乙酰羟酸合成酶脱酸脱酸Thpp：焦磷酸硫胺素：焦磷酸硫胺素-酮酮-羟异戊酸羟异戊酸,-二羟异戊酸二羟异戊酸-酮异戊酸酮异戊酸缬氨酸缬氨酸合成青霉素合成青霉素的前体物质的前体物质次级代谢产物结构具有多样性：次级代谢产物结构具有多样性：（六）次级代谢产物结构多样、特殊（六）次级代谢产物结构多样、特殊包括氨基酸及其衍生物、糖及氨基糖、聚酮包括氨基酸及其衍生物、糖及氨基糖、聚酮体及其衍生物、环多醇和氨基环多醇、吩噁体及其衍生物、环多醇和氨基环多醇、吩噁嗪酮等结构。嗪酮等结构

22、。特殊结构：特殊结构：-内酰胺环、环肽、内酰胺环、环肽、聚乙烯和多烯的不饱和键、聚乙烯和多烯的不饱和键、大环内酯类抗生素的大环等。大环内酯类抗生素的大环等。（七）次级代谢酶在细胞中具有特定的位置和结构（七）次级代谢酶在细胞中具有特定的位置和结构 次级代谢产物与次级代谢酶在细胞中存在的位置有关。次级代谢产物与次级代谢酶在细胞中存在的位置有关。例如：短杆菌肽例如：短杆菌肽S和杆菌肽和杆菌肽A的合成酶是在胞浆中形成的，但的合成酶是在胞浆中形成的，但只有当附着在细胞膜上时才能合成抗生素。只有当附着在细胞膜上时才能合成抗生素。 次级代谢酶系往往是一种多酶复合体，它可以被分离成几次级代谢酶系往往是一种多酶复合体，它可以被分离成几个亚单位，每个亚单位可以保持其酶活性，但作为复合体个亚单位，每个亚单位可以保持其酶活性，但作为复合体的酶活性消失。的酶活性消失。（八）次级代谢产物的合成