前列腺癌特异突变DNA聚合酶β表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化

1、前列腺癌特异突变DNA聚合酶表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化 作者：王明臣 霍玉奇 张善锋 宋宇 赵勤 金国平 董子明【摘要】 目的 观察前列腺癌(CPa)特异突变DNA聚合酶(pol) 表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化。方法 采用业已成功构建的2例特异突变pol表达载体(pCDNA3.1M1和pCDNA3.1M2)，采用脂质体包裹转染NIH3T3细胞，观察比较这些突变对细胞pol基因mRNA和蛋白表达的影响以及引发的相应的细胞周期和细胞自发突变率等细胞生物学行为的变化。结果 筛选得到高表达PCa特异突变pol的NIH3T3细胞株(NIH3T3M1，NIH3T3M2)和

2、高表达野生型pol的NIH3T3细胞株(NIH3T3W)。RTPCR和Western 印迹结果显示，外源DNA pol在转化的NIH3T3细胞中呈现高表达。与转染空载体和未转染的NIH3T3细胞相比，转染PCa特异突变pol的2个细胞株和转染野生型pol的细胞株的细胞周期的S期比例及转染细胞的HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因的自发突变率均显著增加，且转染野生型pol的细胞株亦显著高于转染PCa特异突变DNA pol的细胞株。 结论 DNA pol高表达介导了肿瘤发生的分子机制。 【关键词】 前列腺癌;DNA聚合酶;表达载体;NIH3T3;细胞周期;自发突变率【Abstract】

3、Objective To observe the effect of expression vector containing mutant DNA pol gene derived from prostate cancer on cellular biological behavior when they were transfected into NIH3T3 cell. Methods Two eukaryotic expression vectors containing mutant DNA pol derived from prostate cancer (pcDNA3.1M2 a

4、nd pcDNA3.1M2) were transfected into NIH3T3 cell lines and the effects on gene expression of DNA pol and the corresponding cellular biological behavior including the changes of cell cycle and cellular spontaneous mutation rate were observed. Results The NIH3T3 cell line which overexpressed mutant DN

5、A pol gene derived from prostate cancer and the NIH3T3 cell line which overexpressed wildtype pol gene were all obtained and also presented. The cellular biological behavior included the increase of Speriod frequency (SPF) of cell cycle and the elevation of spontaneous mutation rate of HGPRT gene. M

6、oreover, both the SPF of cell cycle and spontaneous mutation rate of HGPRT gene in cells transfected with wildtype DNA pol were significantly higher than those in the cells transfected with specific mutant DNA pol derived from prostate cancer. Conclusions Tumor genesis is due to the overexpression o

7、f DNA pol.【Key words】 Prostate cancer; DNA polymerase ; Gene expression vector; NIH3T3; Cell cycle; Spontaneous mutation rate随着生活方式的改变及人口的老龄化，前列腺癌(PCa)发生率呈显著增长趋势1。关于PCa发生的确切分子机制尚未阐明。目前认为DNA损伤及修复失灵在肿瘤发生发展过程中起重要作用。DNA聚合酶(pol)是参与DNA合成和修复的重要酶类，维持基因的稳定性25。前期研究证实：国人PCa组织和人PCa PC3细胞株中存在pol基因的多种错义突变形式和突变位点6

8、。基于人PCa pol基因的特异突变形式和位点，又成功构建了2个PCa特异突变pol真核表达载体(pcDNA3.1M1和pcDNA3.1M2)7。本研究拟将这些表达载体转染NIH3T3细胞，观察这些突变形式对细胞pol基因mRNA和蛋白表达的影响以及引发的相应细胞周期和细胞自发突变率等细胞生物学行为的变化。1 材料与方法1.1 细胞培养 小鼠成纤维细胞系NIH3T3购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。常规细胞培养。细胞转染按Invitrogen公司转染试剂LipofectamineTM操作说明书进行，采用G418筛选阳性克隆。1.2 重组载体 PCa特异突变pol表达载体pcDNA3.1M1

9、(768 nt CT和801 nt AG点突变，导致219位 Gln终止码);PCa特异突变pol表达载体pcDNA3.1M2(388nt AG和1071nt TC突变，导致92位 AspGly和320位 PheLeu);野生型pol表达载体pcDNA3.1W，均由本室构建7。1.3 RTPCR检测人或鼠pol的mRNA表达 人pol mRNA检测：上游引物5TGTTTGCCAGCTTCCCAGTA3(824843)，下游引物 5CTCCAGTGACTCCCAAGGGA 3(1 0291 010)，扩增片段长度206 bp。鼠pol mRNA检测:上游引物5TGTTTGCCAGCTTCCCAG

10、CG 3 (751770)，下游引物 5CTCCAGTGACCCCCAGGGGG 3(956937)，扩增片段长度206 bp。人及鼠均采用的内参照GAPDH引物:上游引物5ATCACCATCTTCCAGGAGCG3(250269)，下游引物5ACGTCAGATCCACGACGGAC3 (769750)，扩增片段长度520 bp。用Qiagen公司试剂盒提取细胞总RNA并经逆转录得 cDNA。扩增反应体积为30 l：cDNA 5 l，Mix (含有人或鼠pol引物及GAPDH内参照引物)6 l，Taq酶0.5 l，去离子水18.5 l。94预变性 5 min，94变性50 s，55复性50 s

11、，72延伸60 s，三温循环35次，72末端延伸5 min。1.4 流式细胞仪检测细胞周期的变化 取汇合度达80%90%的细胞，常规消化，PBS洗两遍。2%多聚甲醛1 ml固定5 min，离心，PBS再洗一遍。加A液(胰蛋白酶)250 l/ml样品，轻混，室温放置10 min。加B液(中和液)200 l/ml样品,轻混，室温放置10 min。加C液(PI染料)200 l/ml样品,轻混，28避光放置10 min。用300目尼龙网过滤样品后上机，图像分析采用Cell Quest软件。资料用Madfit LT for Mac 3.0软件分析处理。1.5 Western 印迹检测pol蛋白表达水平

12、收集各组细胞，超声破碎细胞，Bradford测定蛋白含量，取适量样品，进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;电转到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉4封闭6 h;TTBS洗膜5 min×3次。加入一抗工作液(pol1200) 室温孵育1 h。TTBS洗膜5 min×3次，室温。加入碱性磷酸酶标记的相应的二抗抗体 (1500)平缓摇动孵育1 h，室温。TTBS洗膜5 min×3次。加入BCIP/NBT显色液，避光30 min后，蒸馏水终止。1.6 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验检测自发突变率 将5×105个待测细胞(转染和未转染的NIH3T3细胞)接种于培

13、养瓶中，于37，5%CO2培养24 h。进入指数生长期后，胰酶消化，加入含10%血清培养液，混匀，放入离心管以1 000 min离心5 min，弃去上清液，制成细胞悬液并计数。以6×106 个细胞接种于直径为100 mm的平皿中，培养基中含有5 g/ml的6TG(6硫代鸟嘌呤)，37，5%CO2培养7 d，平行作10个平皿。将上述首次消化计数后的细胞每平皿接种200个，培养基中不含6TG，平行作10个平皿，37，5% CO2条件下同样培养7 d。培养结束后，用31乙醇冰醋酸固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。计算自发突变率。自发突变发生率=突变集落数/接种细胞数×1/集

14、落形成率。1.7 统计学处理 应用SPSS 12.0统计软件。数据以x±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多样本均数比较采用方差分析。2 结 果2.1 重组PCa特异突变pol的表达载体转染NIH3T3细胞 转染后首先用400 g/ml的G418筛选，12 d后细胞大量死亡，仅余少量细胞，G418改为维持浓度200 g/ml，经过23 w逐渐形成抗性克隆，扩大培养得到稳定转染pcDNA3.1M1、pcDNA3.1M2的NIH3T3细胞。2.2 重组PCa特异突变pol表达载体转染NIH3T3细胞pol mRNA的表达 见表1，转染pcDNA3.1W、pcDNA3.1M1、pc

15、DNA3.1M2的NIH3T3细胞中均检出高水平的人pol 的mRNA表达，而转染空质粒pcDNA3.1和未转染的NIH3T3细胞中，均未检出人 pol mRNA表达，说明转染表达成功。另外，上述5种细胞鼠pol mRNA表达水平一致，说明转染并未影响NIH3T3细胞本底 pol的mRNA表达。表1 RTPCR检测NIH3T3细胞内 pol mRNA表达2.3 重组PCa特异突变pol表达载体转染NIH3T3细胞pol蛋白表达水平 见图1。未转染及转染空载体的NIH3T3细胞，在39 kD均有一弱蛋白印迹，系NIH3T3细胞自身表达的pol。转染野生型pol载体(pcDNA3.1W)的NIH3

16、T3细胞，在39 kD处可见明显的杂交印迹，说明转染pcDNA3.1W的NIH3T3细胞高效表达外源pol。转染PCa特异突变pol载体(pcDNA3.1M1)的NIH3T3细胞，在26 kD处,可见明显的杂交印迹，缘于pcDNA3.1M1表达的是含有2个突变位点(768 nt CT，801 nt AG)的pol基因，导致219位 Gln终止码，表达仅含219个氨基酸的pol的截短蛋白，说明转染pcDNA3.1M1的NIH3T3细胞亦高效表达外源性pol，在39 KD处还有一弱蛋白印迹，系NIH3T3细胞本身表达的pol。转染pcDNA3.1M2的NIH3T3细胞，在39 kD处可见明显的杂交

17、印迹，说明转染pcDNA3.1M2的NIH3T3细胞亦高效表达外源性的pol。1：转染pcDNA3.1W的NIH3T3细胞;2：转染pcDNA3.1M1的NIH3T3细胞;3：转染pcDNA3.1M2的NIH3T3细胞;4：转染空pcDNA3.1的NIH3T3细胞;5：未转染的NIH3T3图1 PCa特异突变pol表达载体转染NIH3T3的pol蛋白表达2.4 转染重组PCa特异突变pol表达载体的NIH3T3细胞周期的变化 见表2。与未转染和转染空载体的NIH3T3细胞相比，转染野生型pol的细胞株和转染PCa特异突变pol的2个细胞株，细胞周期S期比例均显著性增高(P<0.0

18、5)。且转染野生型pol较之转染PCa特异突变pol的2个细胞株的S期比例亦显著增加(P<0.05)。表2 PCa特异突变pol转染NIH3T3对细胞周期的影响2.5 转染重组PCa特异突变pol表达载体的NIH3T3细胞的自发突变率变化 见表3。使用poisson分布的u检验分析显示，与未转染和转染空质粒的(pcDNA3.1)的NIH3T3细胞相比，转染野生型pol和转染PCa特异突变pol的2个细胞株的自发突变率均显著性增加(P<0.05);且转染野生型pol细胞的自发突变率亦显著高于2种PCa特异突变pol转染的细胞(P<0.05)。表3 PCa

19、特异突变pol表达载体转染NIH3T3细胞的自发突变率变化3 讨 论研究揭示，PCa组织及人PCa PC3细胞株存在pol的多种突变形式和突变位点6。本课题组针对有意义的pol突变形式和位点，采用基因克隆技术，成功构建了两个PCa pol特异突变形式的真核表达载体pcDNA3.1M1和pcDNA3.1M2。本研究结果显示，转染pcDNA3.1W、pcDNA3.1M1、pcDNA3.1M2的NIH3T3细胞，较之未转染及转染空质粒的NIH3T3细胞，均检出高水平的人pol mRNA表达，而上述5种不同类型的细胞中鼠pol mRNA表达水平一致。Western印迹检测亦表明，转染pcDNA3.1W

20、的NIH3T3细胞高效表达外源pol蛋白，转染2种PCa特异突变pol载体(pcDNA3.1M1、pcDNA3.1M2)的NIH3T3细胞，亦高效表达外源PCa突变pol基因相应的pol缺陷蛋白。另外基于NIH3T3细胞株的pol系野生型，不存在pol基因变异，因此本研究揭示外源性pol转染表达并未干预NIH3T3细胞自身pol的表达，即与细胞内源性pol表达无关。高效表达外源pol蛋白的细胞亦引发细胞周期的变化。结果显示，转染PCa突变型pol的2个细胞株和转染野生型pol的细胞株，细胞周期S期比例均明显增高。且转染野生型pol的细胞株较之转染PCa特异突变pol的2个细胞株的S期比例亦显著

21、增加。本研究还利用体外哺乳类细胞次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因突变试验，对外源野生、PCa特异突变pol转染NIH3T3细胞的致基因突变作用进行了评价。结果显示：与未转染和转染空质粒的NIH3T3细胞相比，转染野生型pol和PCa特异突变pol细胞的HGPRT基因的自发突变率均显著升高，且转染野生型pol的细胞的自发突变率亦显著高于转染PCa特异突变pol的细胞。综合研究结果显示，野生型抑或PCa突变型pol转染NIH3T3细胞，在不干扰细胞pol本底表达的状况下，均可高表达外源型pol。又基于NIH3T3细胞的pol与人的pol高度同源8，9，理论上外源型pol表达叠加了转染

22、细胞的pol本底表达，使外源型pol总酶绝对量和活性较之未转染外源pol的NIH3T3细胞为高，从而改变了细胞内不同种类DNA聚合酶的正常功能分布和活性状态，使得本来主要呈现DNA损伤修复酶活性的pol，可因细胞内pol的高比例存在可取代其他种类的DNA聚合酶而更多地发挥其作为次要功能的聚合酶活性而参与DNA的复制。但由于pol缺乏DNA复制的即时校读功能10，复制的保真性最低，因此可能是造成高表达外源pol的细胞遗传不稳定性增加，细胞周期S期比例增加及基因自发突变率升高的分子机制。转染PCa特异突变pol的细胞虽亦呈现相应的pol蛋白的表达，但因其空间构象发生改变，酶活性尤其是参与复制的C端

23、的聚合酶活性受到一定程度影响，故参与低保真性并直接影响基因组稳定性的DNA复制的几率减少。而转染野生型pol的细胞所高效表达的pol蛋白却能有效的参与低保真度复制，又基于NIH3T3细胞自身有完备的pol表达和修复酶功能呈现，不依赖外源表达的pol修复酶功能，很可能是导致转染野生型pol细胞的自发突变率高于转染PCa特异突变pol细胞的缘由，该结果进一步佐证了pol的高表达介导细胞遗传的不稳定性和突变表型形成等细胞生物学行为变化的分子机制。【参考文献】 1 孙颖浩.我国前列腺癌的研究现状J.中华泌尿外科杂志，2004;25(2)：779.2 王谷亮，余应年.DNA聚合酶可能参与了更广泛的细胞反

24、应并引起遗传不稳定J.中国病理生理杂志，2002;18(4)：4279.3 Pavlov YI，Shcherbakova PV，Roqozin IB.Roles of DNA polymerases in replication，repair，and recombination in eukaryotesJ.Int Rev Cytol，2006;255：41132.4 Bergolio V，Pillaire MJ，La Croix Trikim M,et al.Deregulated DNA polymerase beta induces chromosome instability and tumorigenesisJ. Cancer Res，200