Norovirus分子生物学特征及其亚基疫苗研究进展.docx

1、中国农业科技导报，2010,12(6);43-48JournalofAgriculturalScienceandTechnologyNorovirus分子生物学特征及其亚基疫苗研究进展宋维，彭会珍，赵凌侠(上海交通大学农业与生物学院，植物生物技术研究中心，上海200240)摘要:NorovirvsCNVs.il?如病毒)是导致人类非细菌性急性胃、肠炎的主要病原，该病毒可以感染各年龄段人群，全年均可爆发，特别是婴幼儿、老年人和免疫系统缺陷病人属于易感人群。目前临床防治或控制norovirus疫情爆发的重要手段之一是使用疫苗。基于此.对norovirus发现、流行病学特征、分子生物学特征和noro

2、virus疫苗的研究进展加以综述。同时，在比较norovirus的病毒类似颗粒(virus-likeparticles,VLPs)和P粒子(Pparticles)与人组织血型抗原亲合能力的基础上，对利用植物系统特别是番茄果实生产适于口服norovirus的P粒子作为亚基疫苗优势和存在难点以及本实验室的研究进展进行了讨论,以期为利用植物系统表达口服疫苗研究提供些借鉴。关键词:诺如病毒;亚单位疫苗;病毒类似颗粒;P粒子doi:10.3969/j.issn.10084)864.2010.06.08中图分类号:R512.5文献标识码:A文章编号：1008-0864(2010)06-0043-06Res

3、earchProgressonMolecularBiologyFeatureofNorovirusesanditsSubunitVaccineSONGWei,PENGHui-zhen,ZHAOLing-xia(AgricultureandBiologyCollege,ShanghaiJiaoTongUniversity,PlantBiotechnologyResearchCenter,Shanghai200240,China)Abstract:Noroviruses(NVs)arerecognizedastheleadingpath(阻encausingnonbacterialacutegas

4、troenteritisepidemics.NVscaninfectpeopleofallagesandbreakoutallyear-round.Infant,children,theelderlyandimmunodeGciencypeoplearemorevulnerable.Atpresent,vaccineisoneofthemosteffectivewaytoprevent(orcontrol)theoutbreakofnorovirusesdiseaseinclinic.Basedonthis,thispaperreviewedthefinding,epidemiological

5、andmolecularbiologicalfeaturesofnorovirusesandtheresearchprogressonitssubunitvaccine.Throu欧comparingtheaffinitytohumanhisto-bloodgroupantigen(HBGAs)betweenvirus-likeparticles(VLPs)andPparticlesofnoroviruses,theadvantagesanddifficultiesofproducingoralPassubunitvaccineagainstnoroviruseswasdiscussedusi

6、ngplantexpressionsystemsespeciallytomato.TheprogressontheexpressingPparticlesbytransformingtomatoinourlaboratorywasintroducedsimply,hopingtoprovidesomereferencesforproducingoralvaccinebyplantexpressionsystems.Keywords:noroviruses；subunitvaccine；virus-likeparticle；Pparticle收稿日期：2010-06-21；修回日期：2010X)

7、7-17基金项目：国家863计划项目(2OO7AA1OO5O3)；国家转基因重大专项(2008ZX08004SI)资助。作者简介:宋维，硕士研究生，研究方向植物基因工程。E-mail：pixartimeyahoo,com。通讯作者:赵凌侠，教授，博士生导师，主要从事植物星因工程和发育生物学研究。E-mail：lxzhao1Norovirus发现及其流行病学特征1.1Norovirus发现Norovirus(NVs,诺如病毒)是1968年10-11月间美国俄亥俄州Norwalk镇-所小学因突发胃肠炎而被发现的。直至1972年,Kapikian等通过免疫电镜(immunoelectronmicro

8、scopy,IEM)从感染者粪便中才找到致病的病毒颗粒,最初被称为Norwalk病毒，随后被命名为小圆结构病毒(smallroundstructuredviruses,SRSVs)或小圆形病毒。通过对NVs全基因组测序和比较发现,NVs与大多数的SRSVs同源，均属于杯状病毒科(Caliciviridae)。杯状病毒呈对称的二十面体、无包膜，基因组为单股正链RNA。NVs仅感染人，不能体外培养；不过，最近发现了可以在小鼠树突状细胞和巨噬细胞中生K的鼠诺如病毒株心。1.2Norovirus流行病学特征NVs可以感染各年龄段人群，对婴儿感染力仅次于轮状病毒（Wavig,种致婴儿或新生畜胃肠炎的病毒

9、）；幼儿、老人、免疫缺陷人群及器官移植病人狷高危易感人群;幼儿园、学校、疗养院、医院病房、游轮和餐馆等公共场所属于易爆发场所;一年四季均有爆发可能，冬季属于高发期小七NVs以“粪口”途径传播为主，最常见感染途径是接触被污染的食物、水和病人：NVs也可以通过空气传播.患舌呕吐物中NW以气雾状散开，居于此空间的人被感染几率很高：与感染者接触后，该病的发病率高达30%，因而容易导致某些密闭场所如游轮、疗养院的疫情扩大。NVs具有以下.特征使其感染率居高不F：引起感染所需病毒量少（仅需181000个病毒）；病成消亡所需时间K.即使症状有所缓解，患者也有被二次传染的风险9；病毒对温度耐受范围广（060Y

10、）；缺少对传染者的隔离措施和难以获得K期免疫，只要再次接触病毒随时都仃再次被感染的可能;NVs由于基因组易发生突变而不断进化，使抗原发生变化，使易感宿主被感染也2Norovirus分子生物学特征2.1Norovirus基因组结构1990年,Norwalk病毒基因外被成功测序，对从分子病毒学和流行病学角度了解NVs具有重要意义:NVs基因组测序和RT-PCR分析结果表明，该病毒具有.遗传不稳定性和抗原多样性的特点。依据RNA聚合醉区域核昔酸序列多态性.NVsMf以分为5种遗传型，其中I型、II型和传型可以感染人，111型和V型可以分别感染奶牛和小鼠。NVs的I型、II型和IV型又可以分别进一步细

11、分成8个、17个和2个亚型；其中，Norwalk病毒属于1型的1亚型”Nonvalk病毒基因组由7654个核甘酸组成.属于正义单链KNA14c病毒蛋白VPg共价连接到RNA的5味端,RNA的3,末端是polyA尾；基因组RNA作为mRNA有3个开放阅读框（openreadingframes,ORFs）;其中,ORFl编码聚合蛋白.在蛋白酶作用卜.产生6种不同功能的病毒蛋白:p48、核昔三磷酸酶、p22、VPg、Pro酶和Pol（依赖于KNA的RNA聚合酶），均为病毒基因组正链RNA复制负义链RNA所必需的负链R、作为亚基因组复制模板,复制合成包含ORF2和ORF3亚基因组的正链RNA亚基因组中

12、ORF2编码病毒主要结构蛋白VPRORF3编码病毒微小结构$1-1VP2,42.2Norovirus衣壳蛋白Nonvalk病毒是Norminis的一种.其衣壳为正二f-面体，由90个衣壳蛋白分子（capsidiralprotein1,VP1）的二聚体组成。每个二聚体由、-端框架区S和C-端突出区P组成,S区和P区由8敏基酸短肽连接：s|xill装成衣壳，参与二聚体的形成。P区乂分为P】区和P2区,P1区包含大量P折叠和一个螺旋;P2区插入P1区形成6股B桶的结构，包含高度可变的序列，位于衣壳的k面“解析Nonvalk病毒代壳蛋白.聚体X射线晶体结构（见图1）发现,组织血型抗原（histo-bl

13、oodgroupantigen,HBGA）受体位点位于P2区（图1中虚线部分）；因而，P2区在宿主免疫和受体反应中担当者重要角色,并决定着Nonvalk病毒对人HBGA的识别，当发生NVs感染时.P2可作为抗体受体和宿主易感性因子NVs只能寄生于活的宿主细胞内，无法在体外培养，不过NVs的VP1可以自聚集成VLPs（vims-VP1的二级结构SecondarystructureofVP1d4BNTPmcji22VPrPROPOLVPg-RNA,VP1.VP2ORF2ORF3版基因组RNA(-2.8kb)Vfgpi*jvSubgcnomicRNA(-2.8kb)_L_某因组RNA(-7.7kb)

14、GenomicRNA(7.7kb)VLRsVLRsORF1ORF2ORF3图INonsalk病毒衣壳和基因组结构)Fig.1StructureofNorwalkviruscapsidandgenome15.likeparticles）161oVPLs在形态、结构和抗原特性方面与野生型病毒类似，目前对人类Norwalk病毒的认识大多源于VLPs【。VLPs能够诱导产生抗血清，可以用于NVs侵染诊断;VLPs还具有高度的免疫原性，可以引起B细胞和T细胞反应g;因而,VLPs作为亚单位疫苗用于防治NVs感染具有潜在的应用价值。2.3P粒子具有作为Norovirus亚基疫苗的优势VLPs经胰蛋白酶处理

15、,S区可以被完全降解而P区却保持完好无损,9：；PK蛋白经聚合形成二聚体（Pdimer）,并进一步聚合成P颗粒网。2005年,Tan等经凝胶电泳检测发现，P粒子是由12个P区蛋白的二聚体聚合而成,P区蛋白的二聚体和P粒子均其有与HBGA受体结合的能力。进一步研究发现，无S区的VLPs与HBGA受体结合能力要强于含有S区的VLPs（2，1o因此，基于NVs亚单位疫苗的高效性考虑,P颗粒要优于VLPs。HBGA是人体内一类与糖蛋白结合的碳水化合物抗原，具有作为细胞表而受体、信杪传导因了或离子转运通道的功能。广泛分布于人体的上皮细胞和红细胞表面、腺上皮组织及其分泌物中，包括ABO血型系统（包括A、B

16、和H抗原）、Lewis血型系统（包括LeLebJI等抗原）和腺体3个家族，均参与NVs感染后的识别。因而，人类HBGA遗传多样性是导致NVs感染性差异的原因之一。不同NVs宙株与人HBGA的结合存在差异。2002年,Hutson等对8种NVs毒株（I型的NV、C59和VA115；II型的VA207、VA387、GrV、MxV和MOH）研究发现,MOH不能识别Q血型的HBCA,NV不能识别B血型的HBGA,而VA387可以识别腺体和ABO血型的所有HBGAO由于VA387具有识别HBGA的广泛性,VA387的P颗粒是作为NVs亚单位疫苗的-个较理想的候选者，有可能成为今后NVs亚基疫苗研制的重:

17、点。3Norovirus疫苗研究进展3.1疫苗对norovirus的防治全球每年死亡的5700万人中，25%（约1500万）以上被认为与传染病有直接关系，疫苗被认为是目前干预传染病最有效和经济的手段】。在发展中国家,NVs是导致严重腹泻的常见病原，仅次于痢疾居于第二位。据文献记载，印度和秘鲁儿童腹泻分别有15%和31%是由NVs引起,全球每年约有160万儿童因感染NVs而死亡3】。由于NVs的高感染率和突发疫情难以控制，严重威胁若儿童和中老年人群的健康；目前，用NVs特别是VLPs疫苗是预防NVs传染最有效的途径之一。为了防止NVs大范围传染和流行，许多研究者最近将注意力转向了利用基因工程手段

18、制备NVs疫苗或亚单位疫苗。3.2 Norovirus基因工程疫苗用杆状病毒表达Norwalk病毒的VP1,所形成的VPLs在形态、结构和抗原特性方面均与野生型病毒类似;杆状病毒表达的VLPs（肠外、口服或鼻腔注射给药）对小鼠均具有较高的免疫原性酵性具有快速繁殖和易于规模化培养的特点，是目前生物制药业广泛使用的口服疫苗（药用蛋白）表达系统网，小鼠通过肌肉注射或喂饲酵母源的VA387（norovirus的一个毒株）的VLPs,可以产生免疫应答；未经纯化的酵母提取物即使在没有佐剂的情况下，也可诱导小鼠产生免疫反应3）。昆虫细胞也是目前药用蛋白的重要表达系统之一叫，用昆虫细胞表达重组Norualk（

19、rNVs）的VLPs,可以诱导小鼠体液和黏膜免疫，产生血清免疫蛋白IgC和肠免疫球蛋白IgAt32;口服昆虫源的VLPs在人体内也可以诱导免疫可。尽管口服酵母和昆虫源VLPs通过人体黏膜免疫可以达到预防NVs的目的，不过从心理接受程度上仍不及植物（蔬菜或水果）源的VLPs,尤其是针对婴幼儿;因而，最近许多研究者已开始研发包括VLPs在内的植物口服疫苗。3.3 Norovirus植物疫苗前景植物细胞无需昂贵的发酵、纯化、冷贮、运输和灭菌给药，是疫苗或生物药生产的理想反应器，特别适于口服给药：231o1990年，自从Curtis和Cardineau用转基因烟草（NicotianatabacumL.

20、）表达变异链球菌（Streptococcusmutans）表面蛋白抗原A（surfaceproteinantigenA,SpaA）防治解齿的第一例植物疫苗问世以来，近20年间用植物表达抗原蛋白（疫苗）的研究已有大量报道。据不完全统计,截止目前针对艾滋病（humanimmunodeficiencyvirus,HIV)列、肝炎(hepatitisvi-rus)(36.ffi乱(cholera)1371、狂犬病(rabies)等44种疾病，用包括烟草列、水稻(OryzasativaL.)阿)、番茄(SolanumlycopersicumL.)、苜蓿(MedicagosativaL.)421、马铃J?

21、(SolanumtuberosumL.)331等17种植物已成功表达了81种疫苗或抗原最近，用植物系统表达NV的VLPs也有许多成功报道132441o1996年，Mason等心用马铃薯表达NV的VLPs喂饲小鼠，无论是否有粘膜佐剂很乱毒素的存在，均可以产生血清免疫蛋白IgG和肠免疫球蛋白IgA。2006年,Zhang等用表达NV的VLPs转基因番茄冷冻干粉喂饲小鼠，成功诱导了Ig(；和IgA产生。基于疫苗生产成本和给药方式考虑，近年来对植物口服疫苗研发引起了广泛关注。番茄(So/agmycopersicumL.)作为一种世界性经济作物,其可食用性和成熟的遗传转化技术优于生菜(/U以asaliv

22、aL.)、菠于(Spirwciaoler-aceaL.)、香蕉(防心asapiemumL.)、苹果(MalusdomesticaBorkh)和菊萄(VilisviniferaL.)等植物，是理想的植物口服疫苗表达系统。截至目前，用番茄果实表达包括人类免疫缺陷病毒*、肝炎病素如、霍乱毒索(choleratoxin)网制、轮状病毒(rotavirus)叫、Norwalk病毒、严重急性呼吸综合症(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)、炭疽病(anthrax)(521和狂犬病毒(rabiesvirus)138在内的口服疫苗(抗原蛋白)至少有23种。此前NVs亚单位疫

23、苗多选用完整的VLPs,而最近的研究结果显示，P颗粒在分子最和HBGA亲和性方面均具有优势见，用番茄表达VA387的P颗粒,对提高NVs预防效果和在发展中国家或经济欠发达地应用具有重要意义。4讨论NVs严重威胁着人类健康，特别是对幼儿、老人和免疫缺陷人群;NVs易于在幼儿园、学校、疗养院、游轮和餐馆等公共场所暴发；预防NVs以疫苗最为有效，可用杆状病毒、酶母和昆虫细胞表达亚单位疫苗VLPs,最近用植物系统中表达NVs亚基疫苗特别是口服疫苗倍受关注。尽管用植物包括番茄表达NVs亚基疫苗有许多优点,不过仍存在许多尚待解决的问题。目前，对有关重组类病毒颗粒的免疫保护机制还知之甚少，诱导肠膜免疫和体液

24、免疫能力也有待探明,所介导的系统免疫持续的时间也不甚清楚，特别是NVs不断进化和变异,甚至每年都会有新的毒株出现，再加之对NVs疫苗研究也刚刚起步，使诙研究更加复杂上述问题的解决均有赖于NVs分子病毒学、免疫学和流行病学研究的新突破。同时,用转基因植物(如番茄)表达NVs的亚单位疫苗也存在表达检和生物安全等方面的问题，特别是不同转基因株系、甚至不同世代、生长期和果实成熟度都将影响到靶蛋白的表达危，增加了临床应用的难度。转基因番茄的生物安全性可以通过无选择标记(markerfree)载体构建和在可控环境中(如保护地)栽培策略加以控制，再加之番茄属于自交受粉植物，不必担心因其花粉漂流而带来生物安全

25、问题，这是利用番茄作为表达系统-个有利方面。尽管用植物系统(番茄)表达NVs的P颗粒存在上述一些亟待解决的问题，不过这对于预防NVs感染和流行将是一种有益的尝试，甚至对利用植物系统生产口服疫苗也有一定的借鉴意义。参考文献IAdlerJL,ZicklR.WintervomitingdiseaseJJ.Infect.Dis.t1969.119(6):668-673.：2KapikianAZ,WyattRG.DoiinH,etal.Visualizationbyimmuneelectronmicroscopyofa27-nmparticleassociatedwithacuteinfectiousn

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