VITEK 2 Compact微生物检测系统在生物制剂无菌环境监测中的应用.docx

1、.论著VITEK2Compact微生物检测系统在生物制剂无菌环境监测中的应用房世娣，赵小洁，刘晓凡，宣俊文，钱秋娟，马军兰，魏然兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：目的通过收集生物制剂生产中洁净间环境微生物、微生物限度检测样品，应用全自动微生物检测系统(VITEK2Compact)进行监测分析，评价其适用性。方法利用革兰染色法和VITEK2Compact系统对4种标准菌株和291个纯菌鉴定样本进行方法学验证;对人员及设备表面微生物、沉降菌及微生物限度样本共313个进行曲型鉴定，确认此系统在生物制剂生产中的应用价值。结果共在收集的313个样本中,共

2、检出微生物268株,其中人员及设备表面微生物18株、沉降菌188株、微生物限度62株。可信度均在93%以上。其中革兰阳性菌：藤黄/里拉微球菌46次，库克菌属35次，葡萄球菌属70次；阴性菌：少动鞘氨醇单胞菌38次，鲁氏不动杆菌7次。结论VITEK2Compact微生物检测系统具有高度特异性、敏感性和重复性，并具有操作简便、检测速度快等优点，可广泛应用于医院及疾控中心，尤其对无菌生产环境中微生物的质控和微生物数据库的建立具有重要意义。关键词：V1TEK2compact；微生物数据库;生物制剂；细菌鉴定中图分类号：R12文献标志码：A文章编号：1005-5673(2015)03-0009-06DO

3、I：10.13309/ki.pmi.2015.03.003ApplicationofVITEK2compactmicrobialdetectionsysteminsurveillanceofsterilizedconditioninbiologicalproductionFANGShi-di,ZHAOXiao项e,LIUXiao-fan,XUANJun-wen,QIANQiu-juan,MAJun-Ian,WETRanLanzhouInsliluieofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringRe

4、search,Lanzhou,730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthorWEIRantE-mail:18163721®Abstract:ObjectiveTocollectmicroorganisms/bacteriainenvironmentofcleansite,samplesformicrobiallimit,andVITEK2compactmicrobialdetectionsystemwascarriedtotestingandanalysis,山enevaluatingsuitabilityforthesystem.Meth

5、odsGramstainingandVITEK2compactmicrobialdetectionsystemwereusedincharacterizationoffourkindsofstandardstrainsand291purebacteriaformethodologyvalidation;andbacterialtypeof313sampleswasdetected,whichincludedenvironmentalmonitoringbacteriafmicrobiallimitation,inordertoconfirmthevalueofthissysteminbiolo

6、gicalproduction.ResultsInatotalof313samples,268microbialstrainswerecheckedoutincluding18strainsofsurfacesettledbacteria/microorganismsonpersonnelandequipment,188strainsofsettledbacteria,62strainsofmicrobiallimit,thecredibilityfortheseallare>93%.TheGram-positivebacteriaare46timesformicrococcusluUu

7、s/lylae,35timesforkocu-ria,80timesforstaphylococcus.TheGram-negativebacteriaare38timesforsphingomonaspaucimobilis,7timesforacine-tobaclerIwoffii.ConclusionVITEK2compactmicrobialdetectionsystemhashighspecificity,sensitivityandrepeatability,withadvantages,suchaseasyoperation,fastdetection,andwidelyuse

8、dinhospitalandCDC,especiallyappliedtothequalitycontrolofenvironmentalmicrobiologyinproductionofsterilebiologicalproductstithasanimportantsignificanceinestablishmentoftheenvironmentalmicrobialdatabase.Keywords；VITEK2compact;Microbialdatabase;Biologicalproducts;Bacterialidentification随着药品生产质量管理规范(2010

9、年修订)和中华人民共和国药典(2010年版)的相继推行作者简介:房世娣.医学生物学工程师，主要从事生物的品检定工作。通讯作者：魏然，E-maiL18163721实施，生物制剂的质量管理水平已被提升到了新的高度。无菌检查是一项破坏性试验，因此不得不使用抽样检查的方法°使用的基于统计学的取样方法不管多么完善都存在着风险，特别是对于生物制剂。由于一些细菌生长条件的特异性，经常造成产品出厂时无菌检查合格，而到临床使用时仍会因灭菌不彻底而导致的严重不良反应等问题发生。这种不良反应发生的风险随着灭菌产品微生物污染程度的降低而增大，因此运用有效的微生物鉴定技术对洁净区环境微生物进行周期性检测，掌握

10、其菌种存在的规律性并控制溯源就显得尤为重要。目前,所采用的微生物鉴定技术有三种:传统的手工检测法;分子生物学方法:细菌的16S-RNA测序;生理生化方法:用法国梅里埃公司的VITEK2Compact全自动微生物检测系统。传统的细菌鉴定方法是细菌长出后根据菌落的形态、大小、形状、溶血色素，再进行涂片染色、观察细菌形态、氧化酶实验及对葡萄糖的发酵等生化反应进行判断，此法操作较繁杂，鉴定细萌需要1824h,费时，费力，容易发生主观片面错误；分子生物学技术可以从基因水平鉴定细菌种属，但所需试剂和仪器昂贵，专业性强，适宜在科研上的细菌分类研究，仪器鉴定可在几小时内报告结果疑难菌、少见菌、寄养菌鉴定是传统

11、方法的薄弱之处。因此将传统的检测法与VITEK2Compact全自动微生物分析系统结合,归纳综合，适用于生物制剂生产企业环境微生物的快速鉴定。1材料与方法1.1材料111质控菌株金黄色葡萄球菌LCMCC（B）26003、铜绿假单胞菌CMCC（B）10104,枯草芽胞杆菌CMCC（B）63501、大肠埃希菌CMCC（B）44104，均由中国食品药品检定研究院提供。1.1.2培养基营养琼脂培养基、硫乙醇培养基、改良马丁培养基、玫瑰红钠琼脂培养皿、麦康凯（MaC）琼脂培养基、酵母膏腺葡萄糖（YPD）琼脂培养基、胰酪大豆豚琼脂（TSA）培养皿、沙氏（SDA）培养皿，均由兰州生物制品研究所有限责任公司培

12、养基室提供。1.1.3主要试剂和仪器革兰染色液购自美国BD公司;威泰科GP（革兰阳性）鉴定卡、GN（革兰阴性）鉴定卡、BCL（芽胞杆菌）鉴定卡、YST（酵母）鉴定卡、0.45%氯化钠注射液，均购自法国生物梅里埃公司；V1TEK2Compact微生物检测系统，购自法国生物梅里埃公司;迅数菌落分析一显微成像一体机,购自杭州迅数科技公司;HPY-300微生物限度过滤系统,购自杭州泰林医疗器械有限公司；麦氏浊度比浊仪,购自法国生物梅里埃公司。1.2方法1.2.1质控菌株传代将金黄色菊萄球胸、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌和大肠埃希菌的冻干菌粉安甑掰开，用无菌吸管吸取0.50.8mL的营养肉汤培养基，滴加到

13、安甑中，轻轻旋转安甑并吹打，使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。然后将其新鲜培养物接种至营养琼脂培养基中，于3035T培养1824h传代（不超过5代）；将传代适应的（不超过5代）金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌及大肠埃希菌的新鲜菌落（放置时间不超过24h）,用VITEK2compact进行鉴定分析。L2.2纯菌鉴定将用于生产和科研的鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、肺炎链球菌、沙门菌等的传代菌株培养物新鲜样本291个进行菌型鉴定,根据可信度结果作为考察其稳定性的一个指标。1.2.3样品的采集与制备主要采集2010-2013年的人员及设备表面微生物、沉降菌、浮游菌及微生物限度样品共313个。

14、人员：压指试验、表面接触（头、胸、手腕、肘、膝盖）平皿;设备：表面擦拭;环境:沉降菌（A级、B级、C级、D级）、浮游菌（A级、B级）。将所有阳性平皿送菌型鉴定;微生物限度:将生产科室的注射用水和纯化水系统水点每周取样一次，按照中国药典规定的微生物限度检测标准操作细则进行O12.4环境微生物菌型检测将所培养的单颗菌落或纯分的菌落进行菌落特征观察，经革兰染色，鉴别其是革兰阳性杆菌或是球菌、革兰阴性杆菌或球菌,选用适宜的鉴定卡。然后按照VITEK2Compact全自动微生物分析系统仪说明书中的标准操作流程进行测定，一般210h给出鉴定结果。1.2.5菌型结果判断标准VITEK2Compact微生物检

15、测系统的生化鉴定是根据不同微生物的理化性质，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果，一旦鉴定卡内的终点指示孔到达临界值，则表明此卡已完成鉴定。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值（），,按此值的大小对检测可信度作出评价。可信度96%-99%为极好,95%92%为较好,91%89%为好,88%85%为可以接受，85%以下的可信度为低分辨率的鉴别。对于只鉴定到属的菌株,还需根据报告提示信息进行补充试验,进一步鉴别到种。2结果2.1质控菌株检测分析用VITEK2Compact微生物检测系统对已知的金黄色葡

16、萄球菌、铜绿假单胞圉、枯草芽弛杆菌和大肠埃希幽共4株标准菌株作为质控菌株进行检测，结果与已知完全相符，可信度在97%以上，见表1。2.2纯菌鉴定20102013年纯菌鉴定样本291个，菌型分析结果见表2。表1三种质控菌株分析结果(方法学验证)Tab.1Theanalysisresultsofthreekindsofbacteriaforqualitycontrol(validationofmethodology)质控菌株名称革兰染色结果VITEK鉴定结果（）金黄色葡笥球菌CMCC（B）26003阳性球菌可信度99铜绿假单胞菌CMCC（B）10104阴性杆菌可信度99枯草芽胞杆菌CMCC（B）6

17、3501阳性芽胞杆菌可信度97大肠埃希菌CMCC(B)44104阴性杆菌可信度99表2九种菌株菌型分析统计结果(方法学验证)Tab.2Statisticalresultsinanalyzingninestrainsofbacteria(validationofmethodology)微生物名称革兰染色结果检测次数可信度范围（）肺炎链球菌阳性球菌5095-97志贺菌群阴性杆萌2296-99沙门菌群阴性杆菌1994-99大肠埃希菌阴性短杆菌2697-99乙型副伤寒沙门菌阴性杆菌1596-98奇异变形菌阴性杆菌49596鼠疫耶尔森曲阴性杆菌11493-99霍乱弧萌阴性弧状694-98马耳他布曾菌阴性

18、球杆菌3595992.3环境微生物数据库的建立通过对所收集的环境及制品染菌共313个样品（其中人员及设备表面微生物25个;沉降菌228个;微生物限度66个）的检测结果进行整理和分析。共检出微生物268株,其中人员及设备表面微生物18株；沉降菌188株;微生物限度62株，见表3和表4。2.4不同样品菌型签定结果对环境检测样品（人员及设备表面微生物和沉降菌）及微生物限度样品检出微生物的趋势，见图1和图2。结果分析:人员及设备表面微生物主要以沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌和玫瑰库克菌等革兰阳性菌为主，占72.2%以上，其次是鲁氏不动杆菌和少量巨大芽胞杆菌等;沉降菌样本以革兰阳性球菌居多，主要为葡萄球菌属

19、，藤黄/里拉微球菌，玫瑰库克菌等，占检出菌的69.7%,而以少动鞘氨醇单胞菌为主的革兰阴性杆菌次之，占23.9%o短小芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌等，革兰阳性芽胞杆菌出现频率较高为4.8%；微生物限度检测样本以少动鞘氨醇单胞菌、代尔夫特食酸菌及鲁氏不动杆菌为主的革兰阴性杆菌，占检出菌的40.3%o其次为解甘露醇罗尔斯顿菌、皮氏罗尔斯顿菌均为革兰阴性短杆菌，占14.5%,霉菌检出率为9.7%。表3沉降菌菌型分析结果Tab.3Analysisresultsforbacterialtypeforthesettledbacteria/microorganisms沆降菌频数,沉降菌频数.人葡萄球凿18溶血菊萄

20、球菌8变异库克菌8地衣芽胞杆菌1藤黄微球菌38成团泛菌1少动鞘氨醇单胞菌27表皮菊萄球菌12红斑丹毒丝茜2枯草芽胞杆菌1解脉寡源杆菌1蜡样芽胞杆菌3短小芽胞杆菌3金黄色葡葡球菌1缓慢芽胞杆菌1马耳他布鲁篱1腐生葡萄球菌3鲁氏不动杆菌2科氏前匐球菌科氏亚种9缺陷短波单胞菌1肠膜明串珠菌葡聚糖亚种1苛氧颗粒链菌1玫瑰库克菌15人苍白杆菌2嗜麦芽寡氧单胞菌1皮氏罗尔斯顿菌1耳炎差异球菌2施氏假单胞菌1缓症/口腔链球菌1杀酷气单胞询1血链球菌1居泉沙雷曲1克氏库克菌3创口博德特萌1泛曲属2侵肺巴斯德菌1沃氏葡萄球曲10无花果沙雷曲1紫色色杆菌1注:“*”表示样品检测出微生物的次数。表4微生物限度、人员

21、及设备表面微生物菌型分析结果Tab.4Analysisresultsofbacterialtypeforthemicrobiallimitation,surfacesettlementofbacteria/microorganismsonpersonnelandequipment微生物限度频数.人员及设备表面微生物频数.少动鞘氨醇单胞菌11温和气单胞落1玫瑰库克菌5变异库克菌1藤黄微球菌7玫瑰库克菌2洋葱伯克霍尔德萌1表皮菊葡球菌4代尔夫特食酸菌3鲁氏不动杆菌1解甘露醇罗尔斯顿菌3沃氏葡萄球菌3沃氏葡萄球菌2肺炎克雷伯曲臭鼻亚种1香味曲2巨大芽胞杆菌1支气管炎博德特菌3藤黄微球菌1溶血季生球菌

22、1克氏库克菌1苛氧颗粒链菌4人菊葡球菌1毗邻颗粒链菌1放射根痛菌1鲁氏不动杆菌4泛菌属1杀酷气单胞萌1皮氏罗尔斯顿菌6大肠埃希菌1每菌6注:“*”表示样品检澳I出微生物的次数。人员及设浙表面微生物沉降菌微生物限度商图1人员及设备表面微生物、沉降笛、微生物限度菌型分析统计结果Fig.1Analysisresultsabouttypeforbacteriaormicroorganismssurfacesettlementonpersonelandcquipment,andmicrobiallimitation图2不同样品来源微生物污染趋势分析Fig.2Thetrendanalysisofmicro

23、bialcontaminationforsamplesfromdifferentsources3讨论从菌型分析结果可知，生物制剂生产企业洁净区人员及设备表面微生物及沉降菌样品检出率最高的是革兰阳性菌,而居其首位的藤黄/里拉微球菌和葡箭菌福，此类菌种为洁净区环境及人员监测的主要施群，环境中无处不在，主要存在于人体皮肤表面及呼吸道和口腔的分泌物,均为人员带入，应做好个人防护，树立无菌观念,从根本上降低污染的发生。沉降菌样品检出的短小芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌等,主要存在于土壤中，芽胞对热、干燥'辐射、化学消毒剂和其他理化因素有较强的抵抗力，一般常用的消毒剂很难去除，应选用特殊的强消毒剂。微生物

24、限度所检出的解甘露醇罗尔斯顿菌、皮氏罗尔斯顿菌为革兰阴性短杆菌,有芽胞，好氧菌。因封闭的注射用水（80T保温循环）和纯化水（20T保温循环）经多重处理后微生物滋长的营养成分减少，在科室用水的定期微生物限度检查所出现的超标平皿,应做菌型鉴定并与环境检测结果作对比,寻找微生物的来源。另外，对于霉菌,从检出时间和企业所处地域分析，主要出现在湿度较大的南方地区，而对于空气相对干燥的西北地区霉菌的检出率更低，但也不容忽视。应对注射用水管道进行灭菌、纯化水管道消毒，并在春夏季节加强对各出水口的消毒处理。实验中是对生物制剂生产过程中微生物污染状况的初步探索，以法国生物梅里埃全自动微生物分析仪应用于生物制剂生

25、产企业中日常环境微生物监控是十分必要的。该系统具有鉴定快速、准确、自动化程度高、操作简便、功能广泛等优点,尤其是GP卡和GN卡研究较为成熟，鉴定准确性最高，可进行快速鉴定。VITEK2Compact微生物检测系统鉴别含多种细菌的样本中的不同细菌时，需进行纯菌分离直至单颗菌落。革兰阴性菌，与革兰阳性菌在难于区分的情况下,可选择MaC琼脂作为纯化培养基;对于较难培养的菌株,也采用血平板进行纯培养。采集的环境微生物由于物理、化学的消杀或暴露了较长时间，菌株可能存在一定的损伤和变异，因此有必要对送检菌株进行复壮和再次纯化。通过菌型分析结果，能够发现生物制剂生产企业环境中微生物污染的一般规律，在现有环境

26、检测微生物数据的基础上建立基因分型的数据库，可更好地应用于生产过程中的监控。参考文献11池王肉，宋庭，周芳芳，等.微生物鉴定技术在无施药品生产企业中的应用J.中国医药导PJ.2012,14（1）:169-172.2LeclercqA,JoostenH.RobichonD.Comparisonofthephenoly-pingmethodsID32EandVITEK2CompactGNwith16SrRNAgenesequencingfortheidentificationofEnterobactersakazakii（J.JClinMicrobiol,2007,45（6）：2048-2050.

27、（3袁应华，单咏梅.参加微生物学室间质控6年忌靖J.上海铁道大学学报,1998,19（11）:53-54.4王庆飞，徐栋.系统化细菌鉴定方法的探索及其启示J.医学与哲学,2005,26（12）:50-65.5国家药典委员会.中华人民共和国约典（三部）S.北京：化学工业出版社，2010：附录89.92.6中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T16294-2010,医约工业洁净室（区）沉降菌的测试方法S.北京：中国标准出版社，2010.7中华人民共和国国家质谶监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T16293-2010,医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法S.北京：中国标准出版社，2010.8国家药典委员会.中华人民共和国药典（三部）S.北京：化学工业出版社，2010：附录98-99.9林秋云，尹映华.全自动微生物分析系统在微生物检验中的应用J.中国热带医学，2006,6（8）:1477-1520.收稿日期：2014-12-02修回日期：2015-01-12缜辑：王祖森分分分公套分套公分会会行会会分会分ssssssssaa公公s