博尔纳病病毒感染对少突胶质瘤细胞中IL1β表达量的影响

1、博尔纳病病毒感染对少突胶质瘤细胞中IL-1表达量的影响【摘要】 目的 探讨博尔纳病病毒（Borna disease virus,BDV）感染对少突胶质瘤细胞 (oligodendrocyte,OL)中白细胞介素1（interleukin 1，IL-1）蛋白表达的影响。方法 首先将OL和BDV感染的OL煮沸裂解，分别提取蛋白混合液，测定蛋白的浓度后，将二者的蛋白混合液浓度均调至10 g/L，分别取蛋白混合液及其经10000 r/min离心5 min后的上清，沉淀后分别进行斑点免疫印迹试验（dot-blot hybridization），检测OL和BDV感染的OL中IL-1的存在；同时，对提取的O

2、L和BDV感染的OL中的蛋白混合液进行2倍系列稀释后进行斑点免疫印迹试验，检测细胞中的IL-1的表达量的变化。结果 斑点免疫印迹试验表明，OL和BDV感染的OL中提取的蛋白混合液及收集的沉淀均出现杂交阳性信号，而蛋白混合液离心后的上清未出现杂交阳性信号。等量的OL和BDV感染的OL的蛋白混合液经2倍系列稀释后进行斑点免疫印迹试验,OL的蛋白混合液在32倍的稀释度范围内有杂交阳性信号，BDV感染的OL的蛋白混合液在8倍的稀释度范围内有杂交阳性信号。结论 IL-1在OL和BDV感染的OL中均存在,且存在于本实验获得的蛋白混合液和沉淀中。BDV感染使OL中的IL-1的表达量降低，提示IL-1的表达量

3、下降，有可能使其参与的脑内的免疫生理及病理反应发生变化，这可能是BDV感染致病的机制之一。 【关键词】 博尔纳病病毒；少突胶质瘤细胞；白细胞介素-1；斑点免疫印迹试验 Abstract: Objective To investigate the effects of Borna disease virus (BDV) infection on the expression of interleukin 1 (IL-1) protein of oligodendrocytes (OL). Methods Both OL and the BDV-infected OL were subjected

4、 to boiling lysis, and their protein mixture was respectively extracted. After concentration determination, the protein mixtures were adjusted to 10 g/L and centrifuged at 10000 r/min for 5 min to extract protein mixtures and supernatant, which were precipitated to have dot-blot hybridization, respe

5、ctively for determination of IL-1 in OL and BDV-infected OL. Meanwhile, the protein mixtures extracted from OL and BDV-infected OL were tested by dot-blot hybridization after 12 serial dilution to determine the variations of the expression levels of IL-1 in the cells. Results Dot-blot hybridization

6、showed that positive hybrid signals were present in both the protein mixtures and precipitates extracted from OL and BDV-infected OL, while no positive hybrid signals were detected in the supernatant obtained from centrifuged protein mixtures. Equal amount of protein mixtures of the OL and the BDV-i

7、nfected OL were tested by dot-blot hybridization after 12 serial dilution. Positive hybrid signals were detectable in protein mixtures of OL within the range 132 serial dilution, while in the protein mixtures of BDV-infected OL positive hybrid signals were detectable within the range 18. Conclusion

8、IL-1 are present in both OL and BDV-infected OL, and in this experiment, present in the protein mixtures and precipitates. BDV infection leads to the decreased expression of IL-1, suggesting that the decrease in the level of IL-1 expression might be involved in the changes of immunological, physiolo

9、gical and pathological reactions within the brain and might be one of the pathogenic mechanisms of BDV infection. Key words: Borna disease virus; oligodendrocyte; interleukin 1; dot-blot白细胞介素（IL-1）在周围血中主要由单核细胞、淋巴细胞和巨噬细胞分泌产生，中枢IL-1主要来源于星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和血管内皮细胞。此外活化的小胶质细胞和外周入侵的巨噬细胞也是脑损伤和血脑屏障受损后 IL-1的主

10、要来源。IL-1作为体内作用最强的炎性介质之一，生物学作用非常广泛，如诱导细胞黏附分子表达、吸引中性粒细胞聚集、激活免疫细胞和内皮细胞产生多种细胞因子、诱导炎性细胞因子的基因表达及分泌、促进神经毒性物质的产生和释放等。博尔纳病(Borna disease，BD)是一种中枢神经系统感染性疾病,表现为明显的行为、情感异常，炎症细胞在中枢神经系统内浸润及特异性的病毒蛋白在边缘系统中积聚。目前，关于博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV) 的致病机制尚不完全清楚。一般认为，BDV主要通过诱导机体产生病理性免疫应答而致病。通过基因芯片技术，我们发现在BDV感染的少突胶质细胞（oli

11、godendrocyte，OL）中，编码IL-1的mRNA 发生下调，可导致IL-1的表达量下降，可能使得IL-1对神经系统的作用发生改变，使其参与的脑内的免疫生理及病理反应发生变化，而这可能也是BDV感染致病的机制之一1；通过本研究观察BDV感染对OL中IL-1表达量的影响，进一步解释BDV感染致病的机制。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞 OL和BDV感染的OL均由天本大阪大学生田和良教授惠赠，HeLa细胞由哈尔滨医科大学微生物学教研室提供。1.1.2 细胞培养试剂 0.02%EDTA和含10%胎牛血清(FCS)、1×105 U/L青霉素,100 mg/L链霉素的DMEM

12、。1.1.3 总蛋白提取试剂 双蒸馏水和PBS洗液。1.1.4 斑点免疫印迹试验试剂 三氨基甲烷缓冲盐溶液，TBS洗液,3%的封闭液（3 g脱脂奶粉溶于100 ml的TBS）,一抗(兔抗人IgG)、二抗(羊抗兔IgG)及DAB显色试剂均为博士德公司产品。1.1.5 主要仪器 离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)，摇床(TY-80A/S，金坛市荣华仪器制造厂)，恒温金属浴(BIOER,杭州博天科技有限公司)，微量蛋白核酸检测仪(Eppendorf AG 2233)。1.2 方法1.2.1 细胞培养 将培养至对数期的细胞用含0.02% EDTA的消化液37消化5 min，弃消化液，加入无菌

13、的培养液，用吸管反复吹打细胞，按13比例常规传代培养，每3天传代1次。1.2.2 蛋白提取 将培养至对数期的细胞常规消化后，用PBS液吹打混匀，细胞悬液转移到一个无菌微量离心管中4 2500 r/min离心3 min，弃上清，每管中加入50 l的双蒸馏水，用微量加样器将细胞沉淀混匀，放入金属浴中100裂解10 min，用水冷却后放入到-20冰箱中保存。1.2.3 蛋白浓度的测定 消化，收集培养至对数生长期的OL和BDV感染的OL，经水煮法提取蛋白，用微量蛋白核酸检测仪测定蛋白浓度，每个样本重复3次取平均值。1.2.4 斑点免疫印迹试验检测目的蛋白的存在与分布 将提取的OL及BDV感染的OL中的

14、蛋白混合液用微量蛋白核酸检测仪测定后，将二者蛋白浓度均调至10 g/L，用同样的方法提取等浓度的HeLa细胞的蛋白混合液，将提取的蛋白混合液混匀后，用微量加样器分别取3种蛋白混合液各5 l点在NC膜上作为第1个对照组。将OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液10000 r/min离心5 min，取上清液和蛋白混合液各5 l，沉淀用5 l水重悬作为样本，均进行斑点免疫印迹试验，作为第2个对照组。用含有2×SDS上样缓冲液的3种细胞的蛋白混合液分别点样作为第3个对照组。另取一张NC膜加样同第一对照组作为第4个对照组。待4组全部干燥后，放入盒中加入适量封闭液37封闭1 h，取出前3组的膜将膜

15、转移至封闭盒中，加入用封闭液稀释的第一抗体1100稀释，于37孵育反应1 h，打开封闭盒倾去第一抗体，用镊子将膜移至培养皿中，放在摇床上加TBS洗2次，每次10 min，加入稀释好的酶标第二抗体11000稀释，继续在37孵育反应1 h，打开封闭盒，倾去第二抗体，用镊子将膜移至培养皿中放在摇床上加TBS洗3次，每次10 min，取一个培养皿加入双蒸馏水后，加入DAB 显色试剂显色10 min即可，终止反应，用大量双蒸馏水冲洗，然后将膜放入双层滤纸中或塑料袋中干燥保存。第4组的处理方法同前3组，只是不加一抗封闭，作为一个二抗的阴性对照。1.2.5 斑点免疫印迹试验检测OL及BDV感染的OL中IL-

16、1的差异 将提取的OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液用微量蛋白核酸检测仪测定后，将二者蛋白浓度调至相同，将二者蛋白浓度均调至10 g/L，从BDV感染的OL的蛋白混合液中取10 l加4.5 l的双蒸馏水混匀配平成10 g/L的等浓度点样蛋白，在8个离心管中分别加5 l的双蒸馏水，从配平的10 g/L的等浓度点样蛋白中取10 l加入到第1管中， 再取5 l加入到第2管中，混匀后取5 l加入到第3管中，以此类推，进行2倍系列稀释，OL中的蛋白混合液的处理方法同上，蛋白混合液进行2倍系列稀释后进行斑点免疫印迹试验比较结果，HeLa细胞的总蛋白作为阴性对照。2 结果2.1 蛋白混合液浓度测定结果 O

17、L中的蛋白混合液浓度为10 g/L,BDV感染的OL中的蛋白混合液浓度为14.5 g/L。2.2 目的蛋白的存在与分布 斑点免疫印迹试验检测结果显示，蛋白混合液和沉淀加样区域有杂交阳性信号，而其他的区域均无杂交阳性信号。 对用去离子水加热裂解的OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液，分别加入2×SDS上样缓冲液做斑点免疫印迹试验，并对等量的蛋白不加一抗做斑点免疫印迹试验，HeLa细胞的蛋白混合液作为阴性对照。OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液均有杂交阳性信号，分别加入2×SDS上样缓冲液的OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液均有杂交阳性信号，不加一抗作斑点免疫印迹试验的蛋白

18、混合液无杂交阳性信号，HeLa细胞的蛋白混合液均无杂交阳性信号。2.3 OL及BDV感染的OL中IL-1的差异 在相同蛋白浓度的前提条件下，OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液进行2倍系列稀释后,OL在32倍的稀释度范围内有杂交阳性信号，BDV感染的OL在8倍的稀释度范围内有杂交阳性信号。3 讨论 对OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液进行浓度测定的结果显示，BDV感染的OL中的蛋白混合液浓度较高，其具体机制不明。以往认为病毒感染会干扰细胞本身的蛋白合成，而本实验得出了相反的结果，说明BDV感染对于宿主细胞的影响与已知的其他病毒不同。 IL-1被称为前炎症细胞因子（pro-inflammato

19、ry cytokine）,是启动抗菌炎症反应的关键细胞因子，它能刺激单个核细胞吞噬细胞和内皮细胞分泌趋化因子，刺激血管内皮细胞表达白细胞黏附分子，前炎症细胞因子的这些活性有利于抑制和排除细菌，IL-1具有广泛的免疫调节作用，并有致热和介导炎症的作用2。 本研究结果显示，IL-1存在于提取的蛋白混合液和沉淀中，且OL及BDV感染的OL均含有这种细胞因子，这与文献中报道的中枢 IL-1主要来源于星形胶质细胞、OL、神经元和血管内皮细胞的理论相吻合。IL-1是分泌型的细胞因子，但蛋白混合液的上清中却没有检出，可能是IL-1的量较少；在沉淀中有IL-1检出，但IL-1以什么形式存在沉淀中，尚不清楚1。

20、 斑点免疫印迹试验检测OL及BDV感染的OL中IL-1的差异显示，OL在32倍的稀释度范围内有杂交阳性信号，BDV感染的OL在8倍的稀释度范围内有杂交阳性信号，说明BDV感染的OL中IL-1的表达量降低。IL-1是免疫应答中的细胞因子网络的中心环节，其表达量的降低会使其介导的天然免疫能力降低，表现为抗病毒和抗细菌感染能力的下降，这可能为BDV扩散和致病提供了前提条件。 IL-1的表达量下降会使IL-1对神经系统的作用发生改变，有可能使其参与的脑内的免疫生理及病理反应发生变化，而这可能也是BDV感染致病的机制之一。本实验由于时间限制只是对IL-1表达量的变化进行了测定，至于其具体的变化量、作用机制以及与BDV感染致病的关系，尚有待进一步研究。也有相关文献报道的体内BDV感染引起I