MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究.docx

1、第52卷第2期2013年3月Vol.52No.2Mar.2013厦门大学学报(自然科学版)JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)doi：10.6043/j.issn.0438-0479.2013.02.019MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究董艳美】，张国广很，汪卫。范红军3,陈亮I(1.厦门大学生命科学学院，福建厦门361102；2.潦州师范学院生命科学与技术系.福建潭州363000,3.河南师范大学生命科学学院，河南新乡453000)摘要：研究表明，口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)的VP1蛋白含有关

2、键的抗原决定簇.根据()/HL-JOC12/03猪源FMDV毒株VP1上第141160位叙基酸序列设计引物，利用重橙延伸PCR(SOEPCR)技术将该序列插入在大肠杆菌(.Escherichiacoli)噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点.然后连接到原核表达载体pET28a上，构建了重组表达质粒28a-CP-VPl,转化BL21(DE3),ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1.透射电子显微镜下观察融合蛋白CP-VP1成类病毒颗粒(virus-likeparticles,VLPs)状.间接ELISA实验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型FMDV的阳性血清，30Mg的CP-VP1的VLPs蛋

3、白免疫小鼠后可以诱导其产生高效价的特异抗体.故该口蹄疫病毒抗原决定簇展示在噬菌体MS2上表面的VLPs蛋白具有开发成口蹄疫疫苗的前景.关键词：口蹄疫；MS2噬菌体;抗原决定簇；类病毒颗粒中图分类号：Q78文献标志码：A文章编号：0438-0479(2013)02-0237-07口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirusFMDV)引起的危害牛、猪、羊、骆驼、鹿、耗牛等约70种家畜及野生偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病口句.因为其一旦爆发则传播速度快，流行范围广，补救措施少，可造成上百亿美元的直接经济损

4、失，故被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病，我国规定其为一类动物疾病口.FMDV为单股正链RNA病毒，主要有7个血清型W,近年来，爆发流行于我国境内的大都是。型、A型和AsiaI型.自缅甸98(MYA98)谱系FMDV2010年2月在我国广州白云区疫区首次发现以来，该病毒已经持续地给我国多省的畜牧业造成了巨大的损失，并FL该病毒在不同宿主变异较大虽然传统的灭活疫苗的免疫原性比较好，也在FMD疫情的控制和在动物保护上发挥了极其重要的作用，但是，灭活苗在生产过程中不仅要求严格，且存在安全隐患的问题W,并且免疫动物和感染FMDV的动物无法很好区分，限制了动物产品的出口，此收稿日期：2

5、012-11-07基金项目：福建省科技厅重点项目(2009N0051);福建省自然科学基金项目(2010J01240)；厦门市科技计划项目(3502Z20103007)*通信作者:chenlg外，灭活苗的有效期较短，诸如此类的缺陷使得寻找更安全稳定的新型疫苗成了科学工作者的大方向口】。】2.与传统疫苗相比，基因工程疫苗是一类非常安全高效的疫苗.大肠杆菌(Escherichiacoli)MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3659bp,编码成熟酶蛋白(或A蛋白)、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子口归们.研究发现，体外将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因以及包含

6、基因调节元件的5'非编码序列的基因克隆到表达载体中，诱导表达后的蛋白可自我组装为成熟的类病毒颗粒(virus-likeparticles»VLPs)1-1516-1，且在其外壳蛋白基因的特定位点处插入几个基因可以表达成外源氨基酸展示的VLPs状mm,以此，我们可以开发出VLPs疫苗.VLPs疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，其具有强大的免疫优势：表面结构规则，大小合适，易于被免疫系统识别并产生很好的免疫效果；在血清中的半衰期较长等等口"本项研究选择了O/HL-JOC12/03毒株FMDV的VP1蛋白上关键的抗原决定簇第141160位氨基酸002。对应的核昔酸序列，利用

7、重叠延伸RCR(SOEPCR)插入到MS2噬菌体的外壳蛋白基因的特定位点，经过大肠杆菌诱导表达出O/HLJOC12/03FMDV的抗原决定簇多肽表达展示在MS2病毒样颗粒的表面的VLPs.体外和体内的免疫学实验都证实该VLPs蛋白可以很好地诱导被免疫的小鼠产生特异的抗体，且具有很好的免疫原性本项实验研究结果为进一步开发出新型的FMD的VLPs疫苗提供了实验依据.1材料与方法1.1材料1.1.1菌株、质粒和主要试剂BL2KDE3）表达菌株，为本实验室保存；质粒pMS27（包含有大肠杆菌噬菌体MS2的结构基因序列尸门由美国新墨西哥大学的DavidS.Peabody教授惠赠；限制性内切酶BamHI和

8、N/zeI酶，氨革青霉素、卡纳霉素等抗生素及Taq酶，T4连接酶，dNTPs和克隆载体pMD18-TSimpleVector等购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；DNAMarker和ProteinMarker购自北京天为时代科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；5X蛋白缓冲液、SDS-PAGE配制溶液、磷酸盐缓冲液和电转缓冲液等均按分子克隆实驶指南进行配制.I.1.2实验动物、阳性血清实验选用的15只20g左右的健康清洁级的BAL（B/C）小鼠购自厦门大学实验动物中心；（）型FMDV抗原和豚鼠的阳性血清等购自中国农科院兰州兽医研究所；辣根过氧化物酶标记的兔抗小

9、鼠的IgG抗体购自成都的杰华科技有限公司.1.1.3引物根据PMS27序列设计的扩增出能够自我组装的MS2的5非编码区、成熟酶基因、外壳蛋白基因的序列的引物为U-CP和D-CP.引物序列见表1.根据网站http：/上公布的O/HL-JOC12/03毒株FMDV的VP1基因序列，我们将其141-160位氨基酸的基因设计到2个引物F-1-R98和F-2-F98中.1.2方法1.2.1重组质粒的构建1）对照载体的构建：以pMS27为模板，U-CP和D-CP为引物扩增出MS2的5'非编码区、成熟酶基因、外壳蛋白基因的序列，然后进行N腥I和BamHI的双酶切，酶切后的

10、片段连接到同样线性化的pET28a上，挑取单克隆鉴定，构建了重组质粒28a-CP.2）28a-CPVPl重组质粒的构建：利用SOEPCR技术，以质粒pMS27为模板，两对引物U-CP和F-1-R98注：U-CP引物中序列斜线部分为NheI酶切位点；I>CP引物中序列斜线部分为BamHI酶切位点.引物F-1-R98和F-2-F98下划线部分为19bp的互补片段.表1PCR或者SOEPCR中用到的引物及其序列Tab.1ThesequencesoftheprimersusedinPCRorSOEPCR引物名称引物序列（5'f3'）U-CPCTAGCTAGCTA（；GAGGTTT

11、GACCTGTGCGAGCI>CPAAACGGATCCCAACCATCTACCATTC5-CCTGCCF-1-R98GAGCCAGCACTTGGAGATCGCCTC'T.CACGTTTGGCACAGCGGTACCGCCATT-GTCGACGAGAACF-2-F98GATCTCCAAGTGCTGGCTCAGAAGGCAGCGAGGCCGCTGCCTGGAACTTCT-TTCGTGACTGTCGCCCC及F2F98和BCP分别扩增出上、下游片段，凝胶回收后等量混合做模板，用引物U-CP和D-CP扩增出片段CP-VPK图1）.U-CPF-1-R98IpMS27F2F98F2F98SOE

12、PCRU-CPCP-VP1NVRGDLQVLAQKAARPLPTS图1VP1抗原决定簇展示载体构建示意图Fig.1TheconstructionalschematicdiagramofdisplayvectorofVP1epitopesCP-VP1经过Nhel和BamHI双酶切，然后连接到线性化的原pET28a上.转化到大肠杆菌DH5q中，抗性板上挑出单克隆，鉴定序列正确的质粒命名为28a-CP-VPl.1.2.2重组蛋白的表达与SDS-PAGE分析将重组质粒28a-CP及28a-CP-VPl分别转化大肠杆陶BL21感受态细胞，在含有卡那霉素（5。ptg/mL）的LB液体培养基中培养.用1mm

13、ol/L的异丙基硫代半乳糖昔（IPTG）诱导菌体合成重组蛋白.表达结束后4000r/min,25min离心收集菌体，按V（菌体）:V（破壁液）=1：6的比例加入破壁缓冲液.超声破壁23次，每次约5min.12000r/min离心15min.上清中加入缓冲液，混匀，沸水煮5min,12000r/min离心15min.取15从L上样，进行SDS-PAGE.1.2.3表达蛋白的电镜观察IPTG诱导表达的蛋白质.据分子克隆实验指南四r|.的X噬菌体的纯化实验分别进行纯化操作.在破碎所得的I：清中加固体NaCl至终浓度为1mol/L，室温12OOOr/min离心10min；然后上清中再加固体聚乙二醇PE

14、G8000至终质址分数为10%;离心10min,回收沉淀的VLPs,加适量的水,再加入等体积的三氯甲烷振荡30s；室温6000r/min离心15min,回收含VLPs的水相.即为初纯的VLPs.所得的初纯的VLPs再进行蔗糖密度梯度32000r/min离心6h后,可观察到VLPs位于约35%（质量分数,不同）蔗搪位置处；取出再进行透析.取5透析好的样品经1%（体积分数）的乙酸双氧铀染色5min.自然干燥2h.用JEM2100透射电子显微镜分别观察28a-CP及28a-CP-VP12种表达蛋白的形态.1.2.4重组蛋白免疫原性分析免疫印迹检测：将经SDSPAGE分离的28a-CP及28aCPVP

15、1蛋白质转移至硝酸纤维素膜上.用Tris-HCI（pH6.5）溶液进行洗膜.洗3次.每次3min.将膜置于脱脂奶粉宅温封闭1h.弃封闭液.用PBS洗涤3次.每次3niin.加入豚鼠的阳性血清，置25C3h.弃抗体,洗涤.加入辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠血清（1U000稀释）.弃抗体.洗涤.取复3次.进行E增强化学发光法（ECL）显色.然后显影定影.间接ELISA：以重组28a-CP-VPl的VLPs蛋白为包被抗原.用豚鼠的阳性血清做一抗HRP标记的兔抗豚鼠血清做二抗设置28a-CP蛋白为阴性对照病毒抗原做阳性对照.进行间接ELISA.鉴定重组VLPs能否与阳性血清发生免疫反应.动物的免疫实验：

16、将15只小鼠随机分3组：实验组、阴性对照组及阳性对照组.其中阴性对照组的每只小鼠川28a-CP免疫,阳性对照组中的每只小鼠用传统的灭活疫苗进行免疫.每只小鼠肌肉注射30MgVLPs贺白.每周加强免疫1次.共加强免疫3次.末次免疫后采血.用EL1SA检测血清抗体的特异性和效价，抗体效价定为能发生阳性颜色反应的血清最大稀释倍数.ELISA板每孔包被约15Mg的标准抗原.4C过夜.洗涤液洗涤5次封闭液封闭1.5h,然后加入梯度稀释的待测血清.加阴性、阳性血清作为对照.36.5C温育1h.再次洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠的二抗.加200“L/孔邻苯二胺显色底物.室温避光30min，加入终止液终

17、止反应.用丽标仪测（）D颂值.将空白孔的（）D值设为0.如（）D值大于阴性对照OD值的2.1倍.认为是阳性.2结果2.1表达载体28a-CP-VPl及28a-CP的构建2.1.1CP-VP1片段的扩增以pMS27质粒为模板.以UCP和F1-R98为引物.扩增出上游片段；以F-2-F98和D-CP为引物扩增出下游片段.大小分别为700l）p（T游片段）、1300bp（上游片段）基因片段.片段大小与预期结果相符（图2（a）.上下游基因片段经PCR扩增后的1叫收后作为模板.以D-CP和U-CP为引物进行S（）EPCR.扩增出预定大小2000bp的基因片段（图2（1）.(a)bpM3(l>)(a

18、)M.DL2000DNAMarker；1.T游片断；2.上游片断.(b)M.DL5000DNAMarker；3.S()EPCR产物:CP-VP1.图2CP-VP1的上下游片段及整条片段的扩增电泳图Fig.2Theupstream.downs!reamandthewholefragmentsof(P-VP1wereamplifiedandanalyzedbygelelectrophoresis2.1.2pET28a分别与CP、CP-VP1基因的连接经过BamW1和Nhe酶切的CP及CP-VP1片段连接到同样线性化的原核表达载体匕经过街液PCR鉴定（图3（a）和（b）、福切鉴定与测序鉴定.正确的连

19、接产物分别命名为28a-CP、28a-CPVP1.2.228a-CP及28aCPVPl的表达28a-CP-VPl及28aCP重组质粒转化到宿蹈BL2KDE3）中,活化到以）值为0.6时加IPTG诱导,经SD&PAGE证明rCP、CPVP1融合基因获得了表达.表达产物大小分别约为11和16ku（图l）".j预期大小一致.M20()0CP-VP1(a)(b)(a)M.DL2000DNAMarker；1-2.阳性克隆.(b)M.DL2000DNAMarker；!.阳性克隆.图328a-CP(a)及28a-CP-VPl(b)连接产物的菌液PCR鉴定Fig.3Positiveclone

20、sof28a-CP(a)and28a-CP-VPl(1)wereidentifiedbyPCR-CP-VP1-CP-VP1M.蛋白Marker；!.阴性对照；2.28a-CP表达产物上清；3.28aCPVP1表达产物沉淀,4.28a-CP-VPl表达产物上清.图428a-CP及28aCPVPl诱导表达产物SDS-PAGE图Fig.4SDS-PAGEelectrophoresisresultsofproductsexpressedby28a-C'Pand28a-('PVPl蔗糖.透析后的样品经醋酸铀染色5min.自然F燥2h.28a-CP-VPl纯化后的表达蛋白在10000XJM

21、2100透射电镜下观察，可以看到28a-CP-VPl重组蛋白成直径约为65nm的圆形颗粒.即诱导表达的VLPs（图5）.图528MP-VP1表达的VLPs的电镜观察结果Fig.5ElectronmicroscoperesultofVLPsexpressedby28a-CP-VPl2.3VLPs的电镜观察结果将28a-CP-VPl表达菌株BL2KDE3）中活化后扩大培养至1L培养基,在1mmol/LIPTG诱导下表达，收集菌体.经超声破碎处理后将超声破碎液于37°C恒温培养箱中消化过夜.利用菌体本身含有的RNase除去其中的细菌RNA,而VLPs中的RNA由于蛋H外壳的保护不受影响,将

22、过夜消化的超声破碎液离心弃去沉淀得到含VLPs的上清，上清用PEG8000初步纯化后，通过庶糖密度梯度离心继续纯化.可以住35%蔗糖梯度X域内看到经纯化浓缩后的VLPs,小心取出后进行PBS透析以除去样品中的2.428a-CP-VPlVLPs免疫原性的检测2.4.1蛋白免疫印迹Westernblotting结果显示28a-CP-VPl蛋白与FMDV阳性血清反应.可在16ku附近出现特异性免疫印迹条带，与此相对照的28a-CP蛋白与阳性血清没有相互作用（图6）,表明CP-VP1具有良好的抗原性.2.4.2VLPs蛋白的免疫活性豚鼠的阳性血清做一抗，重组蛋白28aCPVPlM.蛋白质Marker；

23、1.28a-CP-VPl表达产物;2.28a-CP表达产物.图628a-CP-VPl表达的VLPs的蛋白免疫印迹结果Fig.6Immunoblotresultsofpurified28a-CP-VP1VLPsproteins活性的间接ELISA检测结果可以看到,28a-CP-VPl有很好的免疫活性(图7(a).Thegradientdilutionoftheimmunesera(b)免疫小鼠抗血清的抗体效价检测结果图728a-CP-VPl的免疫原性检测结果Fig.7Theresultsof28a-CP-VPlimmunogenicitydetection重组蛋白28a-CP-VPl乳化制成疫苗

24、免疫豚鼠后的抗血清ELISA法测抗血清的效价，结果显示与传统的灭活苗对比，28a-CP-VPl的VLPs蛋白同样能诱导出高效价的抗血清，纯化蛋白免疫后血清的效价约为51200(图7(b).这说明展示了20个FMDV抗原表位氨基酸的VLPs蛋白具有很好的免疫原性.3讨论FMD的爆发和流行给许多国家的畜牧业造成了巨大的危害,发达国家实行“扑杀为主、经济补偿”的综合防控措施，发展中国家主要采用疫苗免疫为主的预防措施，故疫苗的需求市场很大.前人的研究证实。型FMDV的VP1蛋白中的第141160位氨基酸是FMDV最重要的抗原决定簇之一，可以诱导被免疫的肌体产生有效的抗体3°驾.基于此，基因工

25、程疫苗或者合成肽疫苗因为其安全、高效广谱的免疫力等优势，现已得到很大的推广.但是，如果仅仅这20个氨基酸或者这20个氨基酸的重复肽段因为分子质量太小或者构象不足以使得被免疫的动物产生足够的抗体加，故研发者们常常选择将它们与一个大的蛋白或者载体分子或者更多的淋巴细胞识别位点连接皿".本项研究将一段重要的FMDV的抗原表位插入到大肠杆菌MS2噬菌体的蛋白外壳基因的特定位点处，用大肠杆菌表达系统诱导表达后，发现大肠杆菌MS2噬菌体可以将FMDV表位展示且成大小均匀形状规则的VLPs.VLPs疫苗近年来因为其自身具有良好的免疫原性旦质量稳定、安全可靠等优点吸引力众多疫苗研发者的月光°

26、;。.本项研究中也发现展示()型FMDV抗原决定簇的VLPs蛋白活性较好，经过蛋白免疫检测和动物免疫试验，都证实该VLPs有很好的且特异的免疫原性，能诱导被免疫的小鼠产生高效价的抗血清.不管是基因工程疫苗还是合成肽疫苗都是选择一部分免疫原性较好的抗原决定簇作为疫苗的有效成分，而完整的或者近完整的灭活病毒或减毒抗原保留了该病原体的绝大部分抗原性，故免疫效果一般不如后者好.但是我们的实验中VLPs蛋白免疫动物后的抗血清的效价也算理想.由此看来可将该蛋白作为包被抗原，开发成FMDV抗体ELISA检测试剂盒，为进一步研制安全、高效、广谱的FMD诊断试剂盒奠定了基础；且该VLPs蛋白有望进而研发成高效安

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