口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析

1、口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析 作者：王冬梅, 沈文涛, 黎小瑛, 周鹏【摘要】 目的: 筛选出高抗原性的口蹄疫病毒（FMDV）抗原表位组合体, 为能有效启动细胞免疫、 高广谱性的口蹄疫植物疫苗的研究提供研究基础。方法: 通过化学方法合成O、 A型口蹄疫病毒的5个T细胞表位基因和2个B细胞表位基因单链, 采用套叠PCR的方法将T或是B细胞表位基因分别融合成融合体T或B, 利用同尾酶的性质将融合体T和B连接成3种不同融合方式的串连体, 即5TBT3、 5TTB3和5BTT3; 利用马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)载体在烟草叶片中表达各串连体基因、 融合体T

2、基因、 融合体B基因和O型口蹄疫病毒的VP1基因; RTPCR检测各基因在烟草(N.benthamiana)叶片中的转录水平; 间接ELISA及Western Dotblot 检测表达产物的抗原性。结果: 各抗原基因在烟草叶片中成功获得了表达, 表达产物的抗原性因不同的融合方式而呈现差异, 其中以5TBT3的融合方式为最高, 5BTT3次之, 再是5TTB3, 但都高于VP1基因的表达产物, 更高于融合体T或B基因的表达产物。结论: 通过融合口蹄疫病毒的多个表位基因有可能找到一种研制有效启动细胞免疫反应广谱抗口蹄疫病毒的基因工程疫苗的方法, 且T、 B细胞表位的不同组合方式对免疫活性很可能存在

3、一定的影响。 【关键词】 口蹄疫病毒; 表位; 马铃薯X病毒; 烟草 口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒 (footandmouth disease virus, FMDV) 引起一种偶蹄动物共患的急性、 热性、 高度接触性传染病, 被国际兽医局列为头号A类传染病1。该病传播途径多、 传播速度快, 多血清型, 曾多次在世界发生大流行, 研制一种有效启动细胞免疫反应广谱抗病毒的疫苗是成功地防控FMD的先决条件。 人们对FMDV抗原表位进行了广泛的研究, 已经在VP1除外的其他结构和非结构蛋白上发现了某些确实能引起淋巴细胞扩增、 加强体液免疫的肽段。我们

4、利用基因工程的手段表达这些表位基因来研制口蹄疫基因工程疫苗。在植物中表达抗原基因是一种安全、 廉价的基因工程疫苗生产方式, 目前已有较多成功的报道2-4。利用马铃薯X病毒载体在烟草叶片中表达抗原基因是一种快速、 安全的表达系统, 被广泛应用在利用稳定表达系统（核遗传的表达系统）之前检测研究设计的可行性分析及多种应用性的研究中5, 6。本研究我们在合成已经确认的T或B细胞表位基因的基础上, 将其进行融合和串连, 利用马铃薯X病毒载体在烟草叶片中表达不同的串连体基因、 FMDV VP1基因等, 快速、 准确地确定各表达产物的抗原性的免疫活性, 为通过核遗传来稳定表达抗原基因、 研制高效的植物疫苗提

5、供可靠的依据。 1 材料和方法 1.1 材料 Ecoli DH5: 常规克隆宿主菌, 本实验室保存; pMD18T Vector购于TaKaRa 公司; 马铃薯X病毒载体(PVX)PGR107(Kanr)及农杆菌GV3301PLICSa(辅助质粒, 四环素抗性, Tetr)由英国Sainsbury实验室David Baulcombe惠赠。A和O型口蹄疫全毒株的标准血清(抗小鼠)购自中国农业科学院兰州兽医所; 山羊抗小鼠(IgGAP)及显色底物购自华美生物工程公司产品购自脱脂奶粉: 完达山乳品有限公司产品, 其他化学试剂均为国产分析纯。本生烟草(N.benthamiana)由中国热带农业科学院热

6、带生物技术研究所刘志昕研究员惠赠。 1.2 方法 1.2.1 各抗原表位基因单链及引物的合成(TaKaRa公司合成) 1.2.1.1 各表位基因单链合成 采用豆科植物偏爱密码子合成A、 O型口蹄疫结构蛋和非结构蛋白上的7个T、 B细胞表位基因: （1）A型FMD 3A蛋白上的2135 aa位氨基酸, AAIEFFEGMVHDSIK, T细胞表位, 命名为T1; （2）A、 O型FMD 3C蛋白上保守的196210 aa位氨基酸, RSMLLKMKAHIDPEP, T细胞表位, 命名为T2; （3）O型FMD VP2蛋白上的4968 aa位氨基酸, SGLETRVVQAERFFKTHCYD, T

7、细胞表位, 命名为T3; （4）O型FMD VP3蛋白上的81100 aa位氨基酸, LAAKHMSNTFLAGLAQYYTQY, T细胞表位, 命名为T4; （5）O型FMD VP4蛋白上的2040 aa位氨基酸, TQLGDNAISGGSNEGSTDTTS, T细胞表位, 命名为T5; （6）A型FMD VP1蛋白上的138160 aa位氨基酸, TDGPRRGDMGSLTARAAKQLPAS, B细胞表位, 命名为B1; （7）O型FMD VP1蛋白上的137160 aa位氨基酸, GESPVTNVRGDLQVLAQKAARTLP, B细胞表位, 命名为B2。 1.2.1.2 各表位基因

8、融合引物的设计与合成 （1）所有T细胞表位基因融合引物设计: 据套叠PCR技术在基因融合中的应用原理7, 设计10条基因片段融合引物（P1、 P2P10）及2条载体构建引物, 为了各个表位基因在表达成肽段后不相互干扰, 在引物P1P10上引入柔性氨基酸丝氨酸(Ser, TCC)/甘氨酸(Gly, GGA), 或柔性氨基酸天冬氨酸(Asn, AAT)/甘氨酸(Gly, GGA)对应的核苷酸序列; P15、 P16为载体构建引物, 分别引入Cla 、 Ava 和Sal 、 Pst 酶切位点(Ava 和Pst 为同尾酶)（2）2个B细胞表位基因融合引物设计: 同理设计4条引物, P11、 P12扩增

9、B1基因, P13、 P14扩增B2基因, 在引物序列中引入酶切位点同时在2个B表位基因上引入TCCGGA序列, 融合后在2个B表位之间加入丝氨酸(Ser, TCC)/甘氨酸(Gly, GGA) 使表达成肽段后不相互干扰发挥作用, 在P11 和P14上分别引入Cla 、 Ava 和Sal 、 Pst 酶切位点。（3）FMDV VP1基因的引物, P17（引入Cla ）和P18（引入Sal ）。（4）据PVX载体序列设计引物1701和1702。 1.2.2 克隆基因的PCR扩增 1.2.2.1 Klenow 酶对各表位基因单链的延伸 将合成的各表位基因片段, 100变性3 min, 在冰上迅速冷

10、却, 按如下体系加入反应物, 37延伸30 min; 使用Boehringer Mannheim公司的High Pure PCR Product Purification Kit回收各基因片段。 1.2.2.2 各T细胞表位基因的串连PCR扩增 以不同的引物组合（P1、 P2P10）为引物, 分4次PCR(用Pfu高保真酶进行)将5个T细胞表位基因融合后, 再用P15、 P16为引物进行PCR, 加入相应的酶切位点, 用1.2.2.1的方法回收, 回收产物命名为T。 1.2.2.3 2个B细胞表位基因的串连PCR扩增 以P11、 P12/P13、 P14为引物, 分2次PCR将2个用B细胞表位

11、基因融合并引入相应的酶切位点, 用1.2.2.1的方法回收, 回收产物分别命名为B。 1.2.2.4 PCR扩增FMDV VP1基因 以P17、 P18为引物, 以本实验室构建的pBIVP1为模板进行PCR; 用1.2.2.1的方法回收, 回收产物分别命名为VP1。 1.2.3 各PCR产物的克隆、 转化与测序分析 将各PCR产物（T、 B和VP1）与pMD18T Vector 载体连接, 构建克隆载体（pMDT、 pMDB和pMDVP1）, 分别转化大肠杆菌, 经PCR及酶切鉴定后, 阳性克隆送TaKaRa公司作测序分析。 1.2.4 植物病毒载体的构建 利用同尾酶连接反应技术构建植物病毒载

12、体。以同尾酶Ava 和Pst 在克隆载体pMDT和pMDB上进行相应的3次酶切, 连接和转化及鉴定, 获得不同串连方式的中间载体; 各中间载体及克隆载体pMDVP1和马铃薯X病毒表达载体, 分别用Cla 和Sal 双酶切, 以酶切后回收病毒表达载体的大片段与各目的片段连接、 转化, 以载体引物1701和1702为引物对各重组子进行鉴定; 提取阳性重组子的质粒, 电激转化法转化农杆菌感受态细胞, PCR法鉴定获得阳性农杆菌工程菌株, 方法见文献（王关林和方宏筠, 2002）。 1.2.5 烟草的侵染 活化农杆菌工程菌株, 采用注射渗透法侵染烟草植株, 注射完毕后, 置于28培养箱中培养。 1.2

13、.6 利用RTPCR检测目的基因的转录水平 利用RNA提取纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司产品）提取烟草叶片的总RNA, 采用RTPCR试剂盒（Boehringer Mannheim 公司）进行反转录; PCR以载体引物1701和1702为引物, 凝胶电泳分析PCR产物。 1.2.7 点杂交及ELISA检测目标蛋白的免疫原性 采用改良的丙酮沉降法提取烟草叶片总蛋白, 测定总蛋白浓度; Western Dotblot 的杂交及显色和ELISA, 方法参照文献（王关林和方宏筠, 2002）, 每个样品加2个孔。一抗为A、 O型口蹄疫全毒株的标准血清。 2 结果 2.1 基因单链的合成 合成各表

14、位基因的序列为: T1: 5GCAGCAATTGAGTTCTTTGAGGGCATGGTGCATGATAGCATTAAG3; T2: 5AGGAGCATGCTTCTTAAAATGAAGGCACAT ATTGATCCAGAGCCA3; T3: 5AGCGGCCTTGAGACCAGAG TGGTGCAGGCAGAGAGATTCTTCAAGACCCATTGCTACGAT3; T4: 5CTTGCAGCAAAGCATATGAGCAACACCTTCCTTGCAG GCCTTGCACAGTACTACACCCAGTAC3; T5: 5ACCCAGCTTGGCGATAACGCAATTAGCGGCGGCAGCAA

15、CGAGGGCAGCA CCGATACCACCAGC3; B1: 5ACCGATGGCCCAAGAAGAG GCGATATGGGCAGCCTTACCGCAAGGGCAGCAAAGCAGCTTC CAGCAAGC3; B2: 5GGCGAGAGCCCAGTGACCAACGTGA GAGGCGATCTTCAGGTGCTTGCACAGAAGGCAGCAAGAACCC TTCCA3。 2.2 病毒表达载体的构建 通过一系列的套叠PCR技术融合5个T细胞表位基因片段, 组合后的片段命名为T（大小约240 bp）; 或是融合2个B细胞表位基因片段, 组合后的片段命名为B（大小约为150 bp）; PCR扩

16、增O型FMDV VP1基因, 克隆和测序分析, 获得各目的基因; 再经相应的酶切及连接、 转化、 鉴定分析, 获得6种含不同融合方式的串连体, 单独T或是B表位基因片段, 或是FMDV VP1基因的中间表达载体（图1）。 图1 中间表达载体构建的框架 Fig 1 The schematic representation of the intermediate expression vector, PVX 1-6: The expression vector, PVXTTB, PVXTBT, PVXBTT, PVXB, PVXT, PVXVP1, respectively. 2.3 PCR鉴定各

17、中间表达载体转化农杆菌株 利用电激转化农杆菌株GV3301PLICSa, 转化重组的农杆菌株用病毒表达载体上的引物1701、 1702进行菌落PCR鉴定, 结果如图2所示, 表明成功获得了6种含植物病毒载体的农杆菌工程菌株。 2.4 RTPCR检测目的基因的转录水平 在农杆菌株侵染烟草后第2天, 提取各侵染叶片的总RNA, 进行反转录合成cDNA, 再以载体引物扩增获得的PCR产物跑胶检测, 结果如图3所示。从图3中可见, 1、 A2泳道分别出现大小约250 bp和150 bp的条带, 分别对应为T片段和B片的大小; A3-5泳道都出现大小约700 bp的条带, 为酶切连接方式融合的各抗原基因

18、片段（BTT、 TTB、 TBT）对应大小; B7泳道出现约690 bp大小的条带, 与VP1基因片段的大小基本一致, 由此说明各被检测的烟草叶片样品对应泳到都出现了与预期大小相同的电泳条带, 而阴性对照（B8）没有出现, 证明各抗原基因在烟草叶片中获得了转录水平的表达。 2.5 抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析 提取所有被侵染烟草叶片的总蛋白, 测定总蛋白的含量, 并稀释到相同的浓度（约为每毫升蛋白提取液含总蛋白0.350 mg）。取这种总蛋白进行Western Dotblot 及间接ELISA。从图4中杂交斑点的颜色深浅可以初步推测融合表达的多表位肽段的抗原性明显高于单个融合体T或B的

19、表达产物; 各串连体的表达产物在与A型FMDV的标准血清杂交反应中, 免疫反应强度均略高于O型口蹄疫外壳蛋白VP1。将上述蛋白溶液进行间接ELISA检测, 以A或O型口蹄疫全毒株的标准血清为一抗, 每个样品进行2个重复, 在450 nm的波长下读取A值。为研究多表位串连体表达产物所具免疫活性的广谱性, 将分别与A和O型FMD全毒株的标准血清反应所获得的4个A值求平均值得各抗原表位的A, 不同的抗原或不同的组合方式有不同的A, 分别为BTT: 0.2415; TTB: 0.189; TBT: 0.2895; VP1: 0.167; T: 0.1495; B: 0.141; 空载体: 0.041。

20、结果不仅证明了由Western Dotblot 实验推测出的结论, 而且可以看出不同的方式组合在抗原性上存在一定的差异, 以TBT的融合方式为最高, BTT次之, 再是TTB, 但都高于VP1或单独的T、 B细胞表位。 3 讨论 FMDV是一种变异广泛、 多血清和亚型的病毒, 目前有临床效果的疫苗是其灭活疫苗, 但一种型的灭活疫苗只能预防此型FMDV, 对其他型甚至是其他亚型就“力不从心”了, 研究一种广谱抗各型口蹄疫的疫苗对防治口蹄疫至关重要。本研究我们通过人工合成多个关键的抗原表位基因, 并对其采用不同方式的融合表达, 期望找到一种高免疫原性的表达方式或是关键的表位, 为研究一种广谱抗病毒

21、的疫苗提供新思路。从融合表位基因的表达产物与A、 O型FMDV全株的标准血清的免疫反应来看, 其效果好于外壳蛋白VP1, 在一定程度上支持了融合表达多表位基因的设想, 但其在动物体内的免疫反应效果还有待动物实验的结果来证实。FMDV感染寄主后是在寄主的细胞中进行复制和组装, 因此诱导产生记忆性T细胞从而在病毒感染的短时间内启动细胞免疫反应, 这对清除病毒很重要, 研究中合成的多数是T细胞表位基因, 至于其免疫效果更有待于动物实验来证实。 至于在融合肽中T细胞表位和B细胞的不同位置对其免疫原性的研究不多。Esther等寻找位于FMDV非结构蛋白上的T细胞表位时, 曾经试着将O型FMDV VP1上

22、的137156位氨基酸的肽(B细胞表位, 命名为B)与3A上的2135位氨基酸的肽(T细胞表位, 命名为T)按先后两种不同的顺序融合(TB和BT), 免疫实验中发现TB的融合方式免疫原性高于BT。总之, 我们采用3种方式融合, 初步认为TBT的融合方式免疫原性好, 其确切的效果及作用机制有待于进一步研究。【参考文献】 1 Knowls NJ, Samuel AR, Davied PR, et al. Outbreak of footandmouth disease virus serotype O in the UK caused by a pandemic strainJ. Vet Rec, 2001, 148: 258-259.2 He DM, Qian KX, Shen GF