人凝血因子Ⅷ工艺研究进展.docx

1、综述人凝血因子枷工艺研究进展窦姿综述;何彦林审校兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗I：程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：人凝血因HumancoagulationfactorVI,FVHI)是人血浆中重要的蛋白质，是人体内源性凝血途径的主要成分,血液中F1B过低会导致不同程度的凝血功能障碍。目前国内FW大多以血浆冷沉淀为起始原料,采用离子交换层析纯化获得。在此工艺中，血浆的采集、血浆融化、冷沉淀离心、冷沉淀的溶解、层析前样品的预纯化、离子交换层析条件、病毒灭活、冻干工艺均对的质量影响较大,因此主要从这儿方面进行了综述。关键词：人凝血因子制备工艺;质量控制；研究进展中图分类号：R37

2、8文献标志码：A文章编号：1005-5673(2015)06-0065-05DOI：10.13309/ki.pmi.2015.06.016ProgressonpreparationofhumancoagulationfactorVUIDOUZi,HEYan-linIjanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,lid.,CenterforGunsuProvincialVaccineEngineeringResearch,iMnzhou730046,GansuProvinceChinaCorresjwndingauthor:HEYan-lin,E-maill:H

3、ylin_lzAbstract:HumancoagulationfactorUIisanimportanlproteininhumanplasma,itisoneofthemaincomponentsleadingtohumanendogenouscoagulationpathway.lx>wconcentratiunofFHinthebloodwillleadtodifferentdegreeofcoagulationdisorder.Currently,MostdomesticFMproductswereobtainedfromcoldprecipitationbyion-ex<

4、;hangechromatography.Inthepreparationprocess,plasmacollection,plasmamelting,cryoprecipitatemanufacturing,cryoprecipitatedissolving,prepurificationofsamplebeforechromatographyperformance.chromatographyconditions,virusinactivationandlyophilizingprocessallhaveagreaterimpactonthequalityofFVU.Therefore,t

5、hispapermainlysummarizedfromtheseaspects.Keywords:HumancoagulationfactorVID；Preparationprocess;Qualitycontrol；Progress人凝血因子MI(HumancoagulationfactorVIH,F皿)是人血浆中的一种重要蛋白质，是人体内源性凝血途径的主要成分，血液中F圳过低会导致不同程度的凝血功能障碍，即甲型血友病(HemophiliaA,HA)。目前对甲型血友病仍无根治之术,患者需要终生输注FMII来维持正常生活。据世界卫生组织和世界血友病联盟报告，全球HA的发病率15/10万20/

6、10万，中国约为2.27/10万2.84/10万，近年来随着筛选检测手段的进一步发展，HA的“发病率”有升高的趋势。经作者统计，我国20102014各年FID(200IU/瓶)的批签发数任分别为177857瓶、348600瓶、263708瓶、395508瓶、506984瓶。虽然FWI的数量有所增加，但是仍供不应求。为了缓解F1D需求的紧张局面，我国连续多作者简介：窦姿，硕上研究生.主要从串血液制品的研发工作。通讯作者:何彦林.E-mail:Hylin_lz年进口重组FVmo国内FW供不应求的主要原因是原料血浆和生产技术水平。目前国内只有华兰生物、绿十字、山东泰邦生物、上海莱士、上海生物制品研究

7、所有限责任公司少数企业能够生产fui产品。近年来，由于国家政策要求开设新的单采血浆站需要凝血因子类产品，所以现在很多血液制品企业正加紧开发人凝血因子切产品，争取早日上市。本文主要从f训的制备工艺、血浆的采集、冷沉淀的制备、冷沉淀的溶解、层析前样品的预纯化、层析工艺、病毒灭活方法、冷冻干燥工艺等方面进行综述。1人凝血因子'皿的制备工艺随着技术的发展，血源性f郴制剂经历了中纯、高纯、超纯这三个阶段的发展。传统的fui分离制备的方法主要有低温乙醇法、片氨酸沉淀法、PEG分段沉淀法、PEG.甘氨酸分段沉淀法、酸沉淀法等,其中甘燹酸沉淀法是最经典的方法。仅采用沉淀法获得的FW纯度和比活性较低,B

8、ioProductsLab采用肝素重悬结合甘氨酸沉淀方法生产的Factor8Y®比活性仅为2.54.0IU/mg；CSL采用多步沉淀方法生产的HumateP®比活性为38IU/mgjmmuna-te®的纯化工艺引入了离子交换层析，比活性达(70±30)IU/mg。采用层析技术可进一步提高产品纯度。目前国内应用较多的是离子交换层析法，以冷沉淀为原料制备高纯FMB。很多国外企业正在采用亲和层析的方法研制超纯的FVID,这将是未来的研究方向。2血浆采集与冻存原料血浆是指以单采血浆技术采集的供生产血浆蛋白制品用的健康人血浆。原料血浆是血浆蛋白制品企业的命脉。血浆

9、采集、冻存、运输都会影响原料血浆中FMD活性。血浆采集过程中影响FMII活性的因素很多，血浆的保存温度、pH值、血浆中的无机盐离子、微最蛋白酶，以及参与凝血过程的其他蛋白质对FV1I的稳定性均有影响句。有研究表明血浆收集过程中添加的柠檬酸盐含星对FW的稳定性有影响，血浆中C广可被柠檬酸根蟹合,Ca?的减少导致FMD不稳定。原料血浆的冰冻是非常重要步骤，影响原料血浆冰冻的因素有时间、冰冻速率、收集血浆的容器形状及体积和厚薄。苏红等指出把握好时间和温度这两个关键环节，能够最大限度诚少血浆中F刑等不稳定成分的损失。回收血浆或者单采血浆的快速冰冻能防止或降低血浆中FM11的损失，慢速冰冻的血浆则显示冷

10、沉淀F'lfl纯度和问收率受到了影响。血浆于-60X2h内速冻能保持绝大部分FU1的活性，冰冻血浆的保存温度以不高于-30无为宜。快速冰冻血浆应在2h内冻结，核心温度至少下降到-20温度对于凝血因子活性的影响巨大，在温度超过4T融化的血浆因子圳效价失活的非常快，所以原料血浆在运输过程中必需采用冷链运输系统并进行质控°3冷沉淀的制备20世纪60年代Pod等发现冷沉淀中富含凝血因子郴，开创了凝血因子替代疗法的新纪元,从此冷沉淀成为制备FMI的起始原料”罚。冷沉淀是新鲜冰冻血浆(Freshfrozenplasma,FFP)在低温解冻后产生的白色絮状沉淀，其中含有丰富的FMLvonW

11、illebrand因子、纤维蛋白原、纤维结合蛋白以及FX皿。目前国内血液中心制备冷沉淀常用的方法是数控水浴融化离心法和数控水浴融化虹吸法。数控水浴融化离心法指的是将FFP置室温5min后，待双联袋导管变软，将血浆在26Y水浴中融化，待血浆袋中约有60mL冰渣时将其取出后离心，F层大约25mL的沉淀即为冷沉淀。数控水浴融化虹吸法指的是将FFP置室温中5min后，待双联袋导管变软后，使血浆在26t的水浴箱中形成一定的高度落差，上清血浆被虹吸进空袋,冰冻血浆袋中剩余4050mL时即为冷沉淀。同虹吸法相比较，离心法得到的冷沉淀中FW和纤维蛋白原回收率较高"5。徐利强等改良了冷沉淀的制备工艺。

12、其采用数控水浴离心法，通过控制初始温度和融化时间。融化时采用循环水浴解冻箱以保证各血浆袋的温度均匀。控制FFP融化的初始温度为15幻，离心温度为4无可缩短制备时间2h,并能提高FYUI的活性。王万仲等采用数控水浴融化虹吸法后发现,FFP的融化温度是影响冷沉淀的主:要因素，FFP放入水浴箱中需固定并在4幻水浴中自行融化，融化过程中不允许用手捏血浆袋或提出水浴观察的现象。卢少芬等比较了数控水浴融化离心和数控水浴融化虹吸这两种方法后得出：虹吸法能制备高质卡it的冷沉淀且简单快速，但规模化生产中的量较小；血液制品企业制备冷沉淀的规模较大，一般在融浆罐融化血浆后均采用连续流离心机离心。黄瑞等'成

13、比较全面系统的优化了冷沉淀的制备工艺，通过正交试验证明了离心转速、出液温度、进液温度对F1D收率具有显著的影响，获得的最佳制备工艺为：循环水浴2530Y,搅拌速度100r/rnin,离心机转速1400()r/min,出液温度02T，每台连续流离心机进液速度为3kg/mino4冷沉淀的溶解F1B很不稳定，在体外容易被激活，所以对其溶解的条件尤为关键'影响冷沉淀溶解的主要因素有溶解时间、溶解温度、离子强度、溶剂、pH值等"Mori等应用含有3IU/mL肝素的水溶解冷沉淀。梁小明等用冷沉淀5倍重量的溶解液,4肝素钠抗凝,酸沉淀pH在6.26.4时发现蛋自体系稳定、杂蛋白去除效果明显

14、、凝血因子激活概率低仰因子活性最高.可为用因子制备的后期处理提供了可靠的条件保证。他们还发现,若冷沉淀溶解过程中蛋白含量过高，凝血因子激活的概率大，导致絮凝时间变短，而絮凝过程消耗了大最的凝血因子郴;若蛋fl含量过低，蛋白系统不稳定，极易发生变性,最终影响圳的活性。10生产制备时间较长，需要选择合适的抗凝剂，发现冷沉淀溶解液中不加抗凝剂而加入乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediaminetetraacelicacid,EDTA)、枸椽酸钠容易激活，紫凝时间短，加入肝素钠絮凝时间长,能够满足后期工艺。郑炎等U6以肝素钠溶解液和Tris-HCl溶解液，在30龙溶解搅拌1h然后进行聚乙二(Poly

15、ethyleneglycol,PEG)沉淀，离心收集上清后，发现肝素钠作为溶解液的PEG上清比活性与Tris-HCl溶解后的PEG上清相比，比活性高出3倍,并且澄明度也好;PEG浓度为5.0%时澄清度最好。张猛等”采用正交设计优化冷沉淀的溶解工艺参数，发现最佳溶解条件是，肝素钠溶解液是冷沉淀重量的4倍，溶解温度10弋，溶解时间为2h,最佳川为7.2。5层析前样品的预纯化纯化工艺中关键的步骤是对样品的前处理。层析进样前，对于样品的处理方法有酸沉法、PEG沉淀法、AI()H)3吸附法等。酸沉淀主要去除纤维蛋白原和纤维结合蛋白，PEG沉淀法可以去除冷不溶蛋白，A1(OHL主要吸附低相对分子质量的凝血

16、因子。罗亮等'将用肝素钠水溶液溶解后的冷沉淀调节pH至6.2,冷却至室温后离心收集上清，再用PEG沉淀后离心收集上清，用0.1mol/L的aCl调节上清pH为7.0,S/D灭活8h后进样层析。发现对样品进行适当的前处理(PEG沉淀和酸沉淀)，能够显著提高FMD的活性，达到纯化的目的。但是经过前处理的样品比活性只有66IU/mg,采用02弋的Tris-HCl缓冲液洗涤冷沉淀，过层析柱洗脱后，活性高达142lU/mg,达到了纯化的目的。邓志华等(回发现用铝胶吸附时，铝胶含量为冷沉淀质量的6%12%时FVM的比活性不断的升高，当铝胶质量分数达到14%时比活性反而降低。以12%的铝胶吸附得到的

17、冷沉淀的比活性为9.27IU/mg,较之前提高了47.5%,旦吸附PH7.1时比活性高达9.51IU/mg。随后利用酸沉淀法沉淀其他杂质蛋白，结果显示pH6.3时酸沉淀效果最好。沉淀离心后上清液中F1D的比活性为11.50IU/mgo李策生等分析FV1D中试纯化工艺过程后发现,PEG沉淀使样品的比活性提高了将近3倍。6层析工艺虽然冷沉淀中的FMA活性比原料血浆中提高了720倍,但其仍然是-种粗制品，仍含有大量的杂蛋白，注入人体以后会导致不良反应。尽管采用亲和层析法能够获得高纯度、高比活性的FMI,但是亲和层析在解离过程中难免有抗体从亲和柱上脱落，因此存在感染鼠免疫球蛋白的危险，反复输注会引起免

18、疫异常。离子交换层析条件温和，能够保持蛋白质的分子构型，维持其活性，且能够去除S/D灭活过程中的化学试剂，操作简单易行。大部分血浆蛋白需在中性pH条件下保持生物活性，在中性条件下血浆蛋白会带负电荷，因此，阴离子交换层析是分离纯化血浆蛋白最常用的离子交换层析法。影响离子交换层析的主要因素有温度、pH、离子强度、流速，其中pH和离子强度最为重要。早在1991年Burnouf等”。发现离子交换层析中常采用较大孔径和疏水性较好的DEAE-FractogelTSK650M作离子交换材料可获得高比活性的FMD。Cheng等采用两步离子交换层析法直接从血浆中分离FMD,而旦比较了第一步层析中三种凝胶介质后发

19、现,Q-Seph-aroseXL的回收率为40%,Q-Sepharosefastflow的回收率为80%,Q-SepharoseBigBeads的回收率为70%;第二步层析中他们利用Sepharose6FF除去了维生素依赖性的凝血因子，F通的回收率达到了80%。在实验中他们发现Q-SepharoseXL可能有激活F训的作用；洗脱液中含有200mmol/mL的NaCl时对于F1I的活性影响最小、低盐浓度对于F1I有利。罗亮等:发现DEAE-Fractogel对于FMD有很高的吸附力，达到40120lU/mg蛋白，使得FV1B以很高的活性洗脱，从而不需要进一步浓缩就可以直接分装，避免了超滤过程中的

20、活性损失。Mori等m】使用冷沉淀作为初始原料，以3IU/mL的肝素钠溶解冷沉淀后，再以A1(OH)3吸附除去凝血酶原复合物以及3%的磷酸三丁酯和1.1%的吐温-80混合进行病毒灭活后，在同一流速、同一上样虽、同一洗脱条件下对ToyopearlDEAE650、DEAESepharose、DE-AEMacroprep、UnosphereQ、FractogelEMDDEAE、FractogelEMDTMAE和FractoprepTMAE这七种凝胶层析纯化后比较(图1)发现，FractogelEMDTMAE和ToyopearlDEAE650M纯化得到的FVI1具有良好的比活性和1口1收率,Fract

21、ogelEMDTMAE得到的F切的比活性为178IU/mg、回收率为86%,ToyopearlDEAE650M得到的FVI的比活性为161IU/mg、回收率为76%。对上述两种凝胶的载样量和流速试验结果表明,ToyopearlDEAE650M凝胶或因其材料的独特而载样量较低；FractogelEMDTMAE在各种实验条件下，性能均良好，纯化后得到图1使用不同凝胶制备的FW纯度及回收率比较Fig.1ComparisonofFMHpurityandrecoverybydifferentresin图1使用不同凝胶制备的FW纯度及回收率比较Fig.1ComparisonofFMHpurityandre

22、coverybydifferentresin7病毒灭活方法凝血因子产品常用的病毒灭活方法有：有机溶剂/去污剂混合物(Solvent/detergent,S/I)法、干热法、SDH法(S/D法+干热法)、SDN法(S/D法+纳米膜过滤法)。我国在2002年发布了病毒灭活/去除验证指导原则，它要求凝血因子类制品生产过程中应有能特定的灭活/去除脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可使用一种或者多种方法联合灭活/去除病毒。国内的F郴制剂主要采S/D法结合干热灭活(10030min或80T72h)两次灭活病毒来保证制剂的安全。干热灭活对于脂包膜病毒非常有效，但是F1D是蛋1'|质，在使用干热灭活时非常容

23、易变性，因此选择合适的灭活方法对于F郴的质量保证非常重要。在市伟的FW产品中HaemateP®(AventisBehring)采用巴氏灭活(60幻10h)白蛋白作保护剂，AIphanate®(AlphaTherapeutics)为S/D+80X.72h,EmoclotD.I®(Kedrion)为S/D+100X.30min灭活，保护剂不添加白蛋白。D，Amici等对上述三种市售的制剂进行比较研究后发现,病毒灭活方式和白蛋白的含量可能是引起血源性FMA输注后产生FVIB抑制物的因素。除了上述三种产品外，市售的Fanhdi®.Haemoctin®还

24、采用干热灭活法，Be-nate®采用巴氏灭活,Talate®采用有机溶剂和蒸汽灭活相结合的方式。Mori等顷采用S/D法和100幻30min灭活病毒,S/D法对于FW的收率几乎无影响，100°C30min灭活时收率的损失大约为20%0邓靖等24100V、30min干热法对FW指示病毒的灭活后发现，三批FW制品中均未检测到的猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)和猪源脑心肌炎病毒(Enc.ephaloniyocarditisvirus,EMCV),三批制品的活性损失分别是25%、28%.28%o8冷冻干燥工艺药品冷冻干燥指的是将药品溶液在较低的温度

25、下进行冻结,然后将其放在真空下进行升华干燥，去除冰晶，并且等升华干燥完成后再对其进行解析干燥，然后去除药品中结合水的方法。药品在经过冷冻干燥后能够避免氧化，有利于药品的长期保存，还能保证药品中的成分不被破坏，保征有效成分不变质、不流失，EL冷冻干燥过程的封闭操作减少了杂菌和微粒的污染，保证了产品的质量。FV1I是蛋白组分，蛋白质的冻干涉及复杂的相变过程，溶液蛋白含最、含盐量、pH值以及保护剂的种类和含量等因素.对冻干品的结晶形态均有重要的影响回。曹海军等E在含有0.3%甘氨酸+1.5%蔗糖+1.0%白蛋白保护剂的基础上改变了H安酸、蔗糖、白蛋向、木糖醇和精基酸的含量或种类,经过冷冻干燥过程和1

26、0030min灭活过程后发现，各组冻干的FVffl比活性N9.31IU/mL,回收率N84.2%,尤其在干热灭活后的活性差异较为明显。因此其得出在冻干和干热过程中，不同保护剂的作用差异较大，甘氨酸的赋形作用较好,精氨酸对制品中的蛋白稳定作用明显，白蛋白对FB1的保护作用最佳，较高含量的蔗糖不利于冻干过程中水分的去除,木糖醇不适于100乞干热灭活处理的FW制剂。菅K永等“将同一批次的半成品分成多份后分别加入25、50、100g/L的甘氛酸、甘露醇、蔗糖和麦芽糖进行冻干和干热灭活发现，甘露醇作为保护剂，冻干和干热灭活后水分残留最低,复溶时间最短，而H.回收率和比活性最高；不同质量浓度的甘露醇对于制

27、品的水分、复溶时间、活性的影响并不显著。蒋桂香等志发现Nad的含量对F圳冻干品的结晶形态有影响，同添加I%mmol/L甘氨酸作为保护剂的冻干制品相比，随着盐浓度的增加冻干品外观依次变差，由疏松的网孔状结构变成了致密的层状结构，共熔点降低，凝血活性降低，复溶时间延长，含水量增加。8展望国外,高纯度FMD和重组F郴已上市多年，但国内F皿仍面临供不应求的局面。为了缓解此供求的紧张局面，我国已经进口重组FWI,但是重组FMD在使用中有抗体产生的风险，所以扩大血源性FMD的产星迫在眉睫。近几年，国家为了使血浆充分得到利用，进行了价拨冷沉淀生产FMD的试点工作，为缓解FMI的短缺奠定了基础，今后血浆综合利

28、用率的提高仍是重点任务，血源性FMD产品的生产将能逐渐满足FY1I的临床需求，给甲型血友病患者带来了福音。参考文献1梁晓明，黄瑞.周星.等.人凝血因子vm的提取工艺研究j.安徽农业科学,2013,41(30):12043-12048.【2赵永强.李魅星.血友病的基础知识J.社区医学杂志,2012,10(5)：67-68.3 李策生，周志军.胡勇，等.人凝血因子M中试纯化工艺的质最控制IJ.中国生物制品学杂志,2013.26(10):1508-1512.4 蒋桂香，张伟，洪好武，等.人凝血因子MD制品稳定性的研究进展J.中国生物制品学杂志,2015.28(1):95-99.5 苏红谭爱玲.许少英

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