人凝血酶原复合物生产过程中凝血因子活化分析.docx

1、,论著.人凝血酶原复合物生产过程中凝血因子活化分析何彦林，刘晓，潘孟娇，刘晓宇，张璘，张继鹏，张安山，杨晓东兰州生物制品研究所有限责任公同H讨省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：目的通过比较以组分ID沉淀和血浆为原料制备人凝血醵原复合物(Prothrombincomplexconcentrates,PCC)过程中凝血因子活化情况，为选择最适PCC制备原料提供数据支持。方法分别对以组分m沉淀和血浆为原料制备PCC过程中中间品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目进行检定,分析凝血因亍的活化情况。观察以组分01沉淀为原料制备PCC过程中添加肝素能否抑制PCC中激血因子的活化。结果

2、以组分皿沉淀为原料制备的PCC中间品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目均不合格。以蛆分1U沉淀为原料制备PCC生产过程中添加肝素后,PCC中间品的活化的凝血因子活性和人凝血解活性均不合格。以血浆为原料制备的PCC中间品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项日均合格。结论组分ni沉淀为原料制备PCC会增加凝血因子活化的风险，新鲜冰冻血浆可作为制备PCC的原料。关键词：人凝血酶原复合物;凝血因子活化;人凝血醵活性中图分类号：R392-33文献标志码：A1X)1：10.13309/ki.pmi.2014.03.006Analysisofcoagulationfactoractivationin

3、producingprocessofhumanprothrombincomplexconcentratesHEYan-lin,LIUXiao,PANMeng-jiao,LIUXiao-yu,ZHANGLin,ZHAXGJi-peng,ZHANGAn-shan,YANGXiao-dongIjanzhouInstituteofbiologicalProductsCo.,Lld.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Ijanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor.UU-Xia

4、o,E-mailtboylxl006Abstract:ObjectiveToexplorecoagulationfactoractivatesoftheprothrombincomplexconcentrates(PCC)manufacturedusingFIIIprecipitateandplasmaasprimarymaterials.MethodsThePCCproductsweremanufacturedwithusingFIDprecipitateandplasmaasprimarymateriuls,respectively.Heparinwasaddedinthemanufact

5、uringprocessofPCCcreatedbyFIDprecipitate,andthendetectingtheactivityofcoagulationfactorandthromlwgenicily.ResultsIntheconditionofPCCmanufacturedbyusingFillprecipitateasmaterials,theactivatedcoagulationfactor*sactivityandthromlxigenicilyhavenotbeenachieved(hestandardrequirementswhereastheiractivities

6、wereaccordedwiththedemandsafteraddingheparininthemanufacturingprocess.Inthecaseofusingplasmaasprimarymaterialstheiractivitieswerealsoinkeepingwiththequalityrequirements.ConclusionsUsingtheFUIprecipitateasrawmaterialtakeariskofincreasingcoagulationfactoractivation.Theplasmaisagoodmaterialusedfortnani

7、ifacturingPCC.Keywords：Prothrombincomplexconcentrates;(Coagulationfactoractivation；Thn)mix)genicity人凝血酶原复合物(Prothrombincomplexconcentrates,pcc)是一种含有凝血因子n、ix、x四种维生素K依赖性凝血因子,能够促进血液凝固的血浆蛋白制剂。在临床上，PCC主要用于治疗乙型血友病和肝脏疾病以及维生素K缺乏引起的凝血因子含量低下引起的出血症状。另外，在治疗因长作者简介:何彦林，副研究员，主要从事血液制品科研和生产管理工作。通讯作者:刘晓.E-mai】：boylx1

8、006期输注FVIII的甲型血友病患者产生FVI1I抑制剂而引起出血的症状也得到了肯定。在国外，PCC还被广泛用于治疗因过缺服用由维生素K拮抗剂作为抗凝药物引起的出血症状。近年来，随着临床医生的认同,PCC的需求址逐年加大。自PCC制品问世以来，有不少关于输注PCC后导致血栓形成并发症的报道，通常会引起心肌梗塞、弥漫性血管内凝血、动脉栓塞和深部血管凝血。PCC引起血栓的主要原齿是生产过程中活化的凝血因子和其中所含的促凝活性的磷脂等杂质所致。因此，在PCC生产过程中，减少凝血因子的活化和提高PCC制品纯度是减少输注PCC后引起血栓的关键因素。通过检测PCC过程中活化的凝血因子活性和人凝血酶活性，

9、可反映PCC制品中凝血因子的活化情况。组分in沉淀是血浆蛋白低温乙醇生产工艺中的一种废料,富含凝血因子ii、vii、ix、x等成分，因此采用组分ID沉淀为原料制备PCC能够提高废料的综合利用。但是在生产过程中经常面临PCC制品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性不合格的情况，如何改善这种局面是目前PCC生产的关键问题。因此，实验分别采用组分m沉淀和血浆为原料制备PCC,比较两种原料制备PCC过程中活化的凝血因子活性和人凝血酶活性，并在以组分in沉淀为原料制备PCC过程中添加肝素，初步探讨添加肝素后生产的PCC凝血因子活化悄况，为选择最适PCC制备原料提供数据支持。1材料和方法1.1材料和仪器组分I

10、II沉淀来自兰州生物制品研究所有限责任公司血液制剂室低温乙醇压滤工艺生产的废料;新鲜冰冻血浆来自兰州生物制品研究所有限责任公司血液制剂室；缺血小板血浆、脑磷脂、人凝血酶、纤维蛋白原等检测试剂均购自PacificHemostasis公司;硫酸鱼精蛋白、肝素钠均购自Siga-ma公司；柠檬酸三钠、氮化钠、氯化钙、Tris等均购自国药集团化学试剂有限公司。1.2 PCC的制备方法1.2.1组分III沉淀制备PCC的方法组分III沉淀PEG沉淀一>压滤->DEAESephadexA-50吸附平衡、洗涤和洗脱超滤->S/D病毒灭活->DEAESephadexA-50吸附-平衡、洗

11、涤和洗脱-超滤-配制-除菌过滤和分装一>冻干一>干热病毒灭活。L2.2血浆制备PCC的方法血浆一离心去除冷沉淀->DEAESephadexA-50吸附-平衡、洗涤和洗脱一超滤->S/D病毒灭活一DEAESephadexA-50吸附-平衡、洗涤和洗脱一超滤一配制一>除菌过滤和分装T冻干干热病毒灭活1.3 组分III沉淀制备PCC生产过程的取样点在组分III沉淀为原料制备PCC的关键工艺点取样，组分m沉淀溶解液、有机溶剂/去污剂（s/d）处理法灭活病毒前和灭活病毒后、pcc干热法灭活病毒前和灭活病毒后。分别检测各样品的人凝血丽活性和活化的凝血因子活性。1.4 组分II

12、I沉淀为原料添加肝素制备PCC过程的取样点以组分ID为原料添加肝素制备PCC过程中，在关键工艺点取样，对样品进行人凝血酶活性和活化的凝血因子活性的检定。取样点为组分m沉淀溶解液、S/D法灭活病毒前和灭活病毒后、PCC干热法灭活病毒前和灭活病毒后。1.5 血浆为原料制备PCC生产过程的取样点以血浆为原料制备PCC的取样点为S/D法灭活病毒前和灭活病毒后、PCC干热法灭活病毒前和灭活病毒后。1.6 凝血因子的活性16.1活化的凝血因子活性检测依据中华人民共和国药典（三部）2010年版附录IX0活化的凝血因子活性检查法进行检测。活化的凝血因子活性检定的空白采用Tris缓冲液代替样品，判定标准为空白对

13、照凝固时间不低于200秒，试验成立。10倍和100倍供试品稀释液凝固时间均应不低于150秒，判定合格。16.2人凝血酶活性检测依据中华人民共和国药典（三部）2010年版附录IXN人凝血酶活性检查法进行检测。人凝血酶活性的阴性对照采用生理盐水替代供试品，阳性对照采用0.5IU的凝血酶溶液替代供试品。结果判定标准为阴性对照无任何凝块或纤维蛋白原析出，阳性对照有凝块或纤维蛋白原析出，则试验成立。肉眼观察供试品应无凝块或纤维蛋白原析出，判定合格。2结果组分m沉淀制备pcc各工艺点样品裁血因子的活性检测以组分m沉淀为原料制备pcc的各工艺点样品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性检查结果，见表1。Fii+i

14、n沉淀溶解液活化的凝血因子活性合格，但人凝血瓣活性检查中发现有少量纤维蛋白原析出，说明样品中有少最凝血因子活化。PCC制备过程中S/D法灭活病毒前后和干热法灭活病毒前后样品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性均不合格，说明样品中大部分凝血因子已经活化。2.1 组分III沉淀添加肝素制备PCC各工艺点样品凝血因子的活性检测除Fin沉淀溶解液工艺点样品活化的凝血因子活性合格外，其他工艺点样品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两项检测结果均不合格，见表2。表1组分HI沉淀制备PCC各工艺点样品的检测结果Tab.1Theresultsofcoagulationfactoractivationinprepar

15、ingprocessofPCCwithFIDprecipitate样品活化的凝血因子活性（S）结果判定人凝血醯活性结果判定1:101:100Fin沉淀溶解液200220合格无凝块，有少足纤维蛋白原析出不合格S/D法灭活前10198不合格有凝块不合格S/D法灭活后7067不合格有凝块不合格PCC干热法灭活前10087不合格有凝块不合格PCC干热法灭活后4735不合格有凝块不合格表2组分in沉淀制备pcc添加肝素后各工艺点样品的检测结果Tab.2Theresultsofcoagulationfactoractivationaddinghcrpinsodiuminthepreparingproces

16、sofPCCwithFillprecipitate样品活化的凝血因子活性（S）结果判定人凝血酶活性结果判定1:101:100Fm沉淀溶解液300290合格无凝块，有少量纤维蛋白原析出不合格S/D法灭活前130160不合格18h左右纤维蛋白原析出不合格S/D法灭活后133143不合格10h左右纤维蛋白原析出不合格PCC干热法灭活前140169不合格6h后有凝块不合格PCC干热法灭活后7090不合格6h后有凝块不合格2.3血浆为原料制备PCC各工艺点样品凝血因子品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性检测结果的活性检测以血浆为原料制备PCC各工艺点样均合格，见表3。表3血浆为原料制备PCC各工艺点样品

17、的检测结果Tab.3CoagulationfactoractivationofPCCusingplasmaastheprimarymaterials样品活化的凝血因于活性（S）结果判定人凝血酶活性结果判定1:1()1:100S/D法灭活前210200合格无凝块和纤维蛋白原析出合格S/D法灭活后220210合格无凝块和纤维蛋白原析出合格PCC干热法灭活前220210合格无凝块和纤维蛋白原析出合格PCC干热法灭活后200190合格无凝块和纤维蛋白原析出合格3讨论目前，PCC制备的原料主要有血浆、去除冷沉淀、凝血因子训的血浆，低温乙醇工艺中的组分皿沉淀和组分I上清。对于PCC产品来说，降低其在临床应

18、用中的血栓性风险是非常关键的问题。生产过程中活化的凝血因子是引起PCC血栓性的主要原因之一。近年来，有文献报道，在PCC制品或PCC制备工艺过程中通过添加肝素钠、肝素钠和AT-m、优化关键工艺参数等方式可以抑制PCC中凝血因子的活化。曹海军等在制备PCC的过程中通过向血浆中加入0.2IU/mL肝素钠来抑制凝血酶原的激活，最终获得了合格的PCC浓缩物:，本实验结果显示，以组分m沉淀为原料添加肝素和不添加肝素制备的pcc均不合格，这可能是因为组分m沉淀为血液制品低温乙醇法生产工艺的中间品，乙醇会使血浆中抑制凝血因子活化的天然抑制剂灭活,所以采用组分m沉淀为原料制备pcc会增加凝血因子活化的风险。采

19、用血浆为原料制备pcc过程中的取样两个项目均合格。此外，门前兰州生物制品研究所有限责任公司采用低温乙醇压滤法进行人血白蛋白和免疫球蛋白的生产，生产过程中加入了助滤剂，助滤剂含有激活凝血因子的物质，所以，生产中不宜采用组分in沉淀而应采用血浆为原料制备PCC。参考文献.1SorensenB.SpahnDR,InnerhoferP,etal.Clinicalreview:prothrombincomplexconcentrates-«va)uationofsafelyandthromboge-nicity.J.CrilCare,2011.15(1)：201.:2SamamaCM.Prothrombincomplexconcentrates:abriefreviewJJ.EurJAnarsthesiol.2008,25(10)：784-789.3包正琦.何彦林.人凝血酶原复合物制备工艺研究进展J.微生物学免疫学进展.2013.41(4)：79-84.|4啻海军，叶生亮，王宗奎.等.正交试验法优化凝血酶原复合物的制备工艺J.中国生物制品学杂志，2012,25(11):1538-1542.收稿日期：2013-12-26修回日期;2