伪狂犬病病毒载体疫苗研究进展.docx

1、f文献综述勺伪狂犬病病毒载体疫苗研究进展路明华“气路迎迎】点，王宏俊(1.北京市农林科学院畜牧舟医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室.北京100097；2.河北工程大学农学院，河北邯郸056021)摘要：随着分子生物技术的快速发展，伪狂犬病病毒作为疫苗栽体的研究也更加深入。以伪狂犬病病毒部分基因缺失株为载体，与其他病原体的抗原编码基因共同构建重组病毒,进而研制重组疫苗，可达到一针多防安全高效的目的，在实际生产中也有重要意义。论文对以伪狂犬病病毒作为疫苗栽体的研究进行了综述。关键词：伪狂犬病病毒；疫苗；载体中图分类号：S852.659.1文献标识码：A文章编号:1007-5038(2013)

2、06-0136-05收稿日期：2013-01-04基金项目：北京市农林科学院创新能力建设项目(2013006)作者简介：路明华(1987)，男，河北邪台人.硕士研究生，主要从事动物分孑生物学研霓。*通讯作者伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的多种动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病，可致妊娠母猪流产、死产或木乃伊胎。该病最早在1813年发生于美国的牛群中，由于临床表现与狂犬病类似，故称伪狂犬病。1902年Aujeszky证明该病病原为病毒，因而该病亦被称为奥耶斯基病。因其流行快，传播途径多，病死率高，被世

3、界动物卫生组织(OIE)列为二类动物传染病。近年来，随着分子生物学技术的发展，伪狂犬病病毒的分子生物学研究取得了很大进展，若将外源基因插入伪狂犬病病毒基因组中构建重组病毒，不仅保持了良好的抗原性，而且其毒力不返强，易与野毒区别。利用伪狂犬病病毒作为载体同目的基因一起在动物体内表达，既安全乂可达到一针多防的效果，可在多种动物疫病的防控中起到重大作用。1伪狂犬病病毒作为疫苗载体的优势1.1伪狂犬病病毒有强大的外源基因容伪狂犬病病毒属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科，属于DNA病毒.其基因组为线状双链DNA分子，大小约为150kb,分子质量约95X103ku,G+C%含量高达73%,病毒的基因组可以分为长独

4、特节段(UL)、短独特节段(US)及US两侧末端反向重复序列(TR)和内部反向重复序列(IR)L11oUS和UL区段，含有至少70个基因，可编码70种100种蛋白质，成熟的病毒粒子只含有约50种蛋白质。在PRV庞大的基因组中，允许插入或缺失的区域多而且会不同程度的降低该病毒的毒力，同时不影响其本身的繁殖。已有65种基因被定位，其中大多数基因的功能已搞清，可编码包含有70种100种病毒蛋白，其中在US区段已被鉴定的基因分别是gD、gE、gG、gI、蛋白激酶基因、11K和28K8种蛋白基因；在UL区段有58种基因已经被鉴定，包括gB(gI)、gC(gDI)、gH、gK、gL、gM、gN、碱性核酸酶

5、(AN)、核糖核苜还原酶(RR)、DNA多聚酶(POL)、136kuDNA结合蛋白质(DBP)、主要衣壳蛋白(MCP)和早期蛋白0(EP0)等基因。这些基因可编码结构蛋白、转录调节因子、毒力蛋白、酶类以及与病毒DNA复制、病毒释放有关的蛋白。在这些已经鉴定的伪狂犬病病毒基因中，病毒在细胞中增殖的非必须基因超过一半。另外，还有些已知的毒力基因，如g【)、gE、TK等缺失突变之后能显著降低PRV的毒力，这部分DNA序列或基因可以被缺失并被外源DNA置换，而仍使病毒正常生长.这就是PRV作为外源基因表达系统的基础。1.2PRV作为载体有适用性广和安全性好的优点PRV的宿主范围广，绵羊、牛、山羊、猪、

6、猫、狗等家畜都可感染PRV,可有针对性地研制疫苗。现有的基因缺失活疫苗株Bartha-K61或“783”等已在世界上应用了几十年，安全有效，一些国家通过其消灭和根除了伪狂犬病。加之生产成本低，生产工艺简单，原材料来源方便，PRV对人无易感性等特点，使得PRV成为很好的疫苗载体。2PRV作为疫苗载体的研究2.1PRV基因缺失突变株是活载体疫苗研究的基础在PRV基因中缺失一个或多个病毒复制非必须基因，可以使病毒毒力减弱，但同时又不影响自身的繁殖和免疫原性，这样以PRV作为载体携带其他外源抗原基因进入生物体内，不仅可以刺激机体产生对PRV的免疫反应，同时也可以产生对外源抗原的免疫应答。PRV作为载体

7、具有外源基因容量大、易于生产等优势而同时具有生物安全性，所以伪狂犬病病毒活载体疫苗的研制应运而生，已经成为现今疫苗研究的热点。陈瑞爱等构建了PRVTK基因缺失株，将该重组病毒在体外传30代后仍具有良好的遗传稳定性；PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明，重组毒株与原始株（PRV-Ra）在仓鼠肾细胞（BHK-21）上具有相似的增殖规律；但毒力比PRV-Ra下降了10000倍；以IO50TCID5oPRV/TK-免疫小猪后4周，体内产生的平均中和抗体水平达IO51,略高于对照疫苗产生的抗体水平（10L8）o董炳梅等对自行构建的双基因缺失gI-/gE-/PRV

8、SA738株的安全性和某些生物特性进行了研究，结果表明构建的突变株一方面毒力降低，提高了安全性；另一方面激发了机体强而持久的免疫应答，为对抗强毒攻击提供了很好的保护。在已有的研究报道中，多数学者采取了缺失gE.ghTK基因中的一个或多个，也有部分研究对gG、gH进行了缺失突变。试验结果均表明，缺失这些病毒复制非必须基因，会使病毒毒力大大降低，但不会影响病毒的免疫原性和增殖，这使得用PRV基因缺失突变株研制活载体疫苗成为可能。缺失其他基因是否会有同样的作用、基因缺失与插入是否会影响病毒的增殖及免疫原性等也是值得深入探讨的问题。2.2重组伪狂犬病病毒构建过程中常用的转移载体来源各异在构建重组伪狂犬

9、病病毒的研究过程中，多种转移载体都可用来作为构建重组病毒的工具，极大的方便了病毒重组工作的进行，为重组病毒疫苗的研制提供了便利。徐静等将日本脑炎病毒（JEV）CQRC-1株的E基因克隆到pMD18-Tsimple载体中，再亚克隆到转移载体pPI-2.EGFP中，命名为PPE。陈瑾等虻将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒（HP-PRRSV）HuN4株GP5基因与含增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因的表达盒插入到伪狂犬病病毒通用转移载体pgG-uni中，构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFPo李业伟等将狂犬病毒SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因LacZ表达盒克隆至转移载体P8AA中，构建了转移质

10、粒P8AA-LacZ-G。转移载体没有优劣之分，只要能够正确地达到构建的目的，就是好的载体;但为了使构建及鉴定过程顺利进行，可能需要对某些载体进行特定的优化改造。2.3转染细胞多用脂质体或磷酸钙转化法磷酸钙法可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。但对转染过程要求较严格，整个转染过程中都应无菌操作，确保形成尽可能细小的沉淀物，在试验中使用的每种试剂都必须小心校准。邓晓辉等n。用PPVVP2基因和PCV2cap基因构建了重组表达质粒，再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了PPRV-V2C-AgE和pPRV-AgE突变体，该突变体用磷酸钙法转染BHK-

11、21细胞获得了重组病毒。由于磷酸钙法要求的严格，而脂质体法相对来说更简单，所以应用也较多。脂质体法具有操作简便，转化效率比较高，可以用于瞬时转染，也可以用在永久表达系的建立，对细胞类型的运用面广，对转染的核酸类型和分子质量有很高的包容性，细胞毒性小，也可以用于体内的基因转染诸多优点。因此脂质体转染法得到了越来越广泛的应用。但转染温度、时间、DNA与脂质体的比率等对转染均有影响，其中DNA与脂质体的比率是关键。李敏等:购将H1N1和H3N2亚型猪流感病毒（SIV）的HA基因进行了克隆，然后与构建的pUC-P-HlA-H3A重组了表达质粒，用脂质体将其转染已感染PRV的Vero细胞，使其与PRV基

12、因组在Ver。细胞内进行了同源重组。陈杨等从猪细小病毒（PPV）SCl株基因组中扩增出VP2全基因，并将其插入真核表达载体pPI-2.EGFP中，构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将PRVSA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞，筛选获得了重组病毒PRVSA215/VP2株。2.4LacZ或GFP等报告基因是重组伪狂犬病病毒筛选的必备条件报告基因在筛选转化体过程中必不可少的，在基因重组研究中目前常用的件半乳糖昔酶基因（LacZ）和绿色荧光蛋白（GFP）。寇叙等3以伪狂犬病病毒TK/gl缺失疫苗株为亲本株，构建了重组质粒PEGFP-3AB,

13、其中含增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因和含口瞬疫病毒3AB基因的完整表达盒，再转染于猪肾细胞，成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并旦在猪肾细胞中表达了绿色荧光蛋白基因。王印等UQ采用PCR方法扩增了猪圆环病毒2型的（）RF2（PCV2-ORF2）基因.将其插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。然后将其与PRVSA215株基因组采用脂质体介导法共转真核细胞（ST细胞），通过空斑纯化得到表达PCV2ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病病毒SA215（C）经检测，重组病毒能表达具有生物活性的

14、ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。通过LacZ的筛选，LiXM等构建了可以表达口蹄疫病毒P1基因和猴空泡病毒（SV40）poly-A的重组病毒，并获得了稳定的表达。李自力等以日本脑炎病毒（JEV）SA14-14-2疫苗株基因RNA为模板，采用RT-PCR一步法扩增了膜蛋白前体（PrM）基因全长cDNA,并在此基础E以PRVEa株TK-/gG-/LacZ+突变株为载体构建了JEVPrM基因重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/PrM,为进一步研制猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗提供了一个良好的重组病毒株。报告基因的应用使得重组子的筛选非常方便。绿色荧光蛋白（GFP）既对细胞没有损害，且直观易用，与其

15、他标记物相比具有更高的灵敏度和分辨率。LacZ常被用于转化菌株的筛选。此两种报告基因，均有方便直观的特点，目前在伪狂犬病病毒活载体疫苗的研究常被用到。2.5同源重组是基因操作常用的技术手段，而细菌人工染色体（BAC）系统也开始应用于重组伪狂犬活病毒的构建同源重组在基因功能研究，转基因等方面有广泛的应用，在重组伪狂犬病病毒的构建过程中也发挥了重要作用。HanNJ等从PRVBartha-K61株的基因组DNA中通过PCR扩增UL2.1基因的两个片段作为同源臂，然后将PRVBartha-K61株基因组DNA与构建的质粒pUL21-SRV9G-EGFP进行了同源重组。近年来，随着BAC技术的建立和发展

16、，使得在大肠埃希茜中对病毒基因的任意位点进行缺失，插入和位点突变成为可能，很容易制成双、多缺失的基因工程疫苗，也可以引入其他病毒的保护性抗原决定区，构建以PRV为载体的重组多价疫苗。彭金美等U8将PRV基因组和构建的转移载体pUCTK-EGFP-BACII共转染Vero细胞，利用同源重组在BarthaK61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记，经过纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病病毒rv-PRVBAC。尹文玲等口9通过同源重组将携带BAC载体和GFP表达框的pHA2质粒序列插入到PRV的UL23（TK）基因内，获得了重组病毒rPRV-HA2；将该重组病毒的环状基因

17、组电转化到感受态细胞，筛选到病毒的感染性克隆PRVBAC（pPRV）。利用BAC系统构建重组病毒不需要在真核细胞中经过繁琐的传代和空斑筛选，大大简化了基因工程疫苗的研制过程，为基因工程疫苗研究开拓了新的思路。BAC载体具有遗传稳定性好，嵌合率低，容易操作，转化效率高，筛选基因方便的优点，随着研究的深入，BAC越来越显示出其广阔的应用前景。2.6伪狂犬活病毒载体疫苗的研发以猪病为主，针对的病原体有病毒也有寄生虫在猪细小病毒病、口蹄疫、猪圆环病毒病2型以及猪蓝耳病等猪的重要传染病疫苗的研发过程中，以伪狂犬病病毒作为活载体的基因工程联合疫苗巳有大量的研究报道。徐志文等N。将包含有完整阅读框架的PPV

18、VP2基因（1740bp）和PCV2ORF2基因（750bp）插入PRVSA215株，成功构建了重组病毒。ChenY等用PRVSA215和质粒同源重组，构建了重组PRVSA215/VP2,并进行了纯化和鉴定。小猪的免疫试验表明重组病毒能够刺激机体特异性的体液免疫反应，并对PRV致死剂量的攻毒提供完全保护。其安全性、免疫原性和保护率均得到证实，为研制抗PRV和猪细小病毒（PPV）感染的二价疫苗奠定了基础。在寄生虫病疫苗的研究中，聂浩将含有弓形虫SAG1（或MIC3,或GRA7）表达框的DNA片段克隆出来后，插入中间转移载体pgG-Uni,分别构建成为3个重组的转移载体。进一步验证表明获得了正确的

19、重组子，然后提取PRVEaTK-/Gg-/EG-FP+突变株基因组DNA,分别与这3个重组转移载体混合，经脂质体介导共转染到IBRS-2细胞中,经检测表明成功构建了重组病毒株。这为同时预防弓形虫病和伪狂犬病提供了一种可行的候补疫苗选择。WeiF等2刃用PRVBartha-K61株疫苗株做载体，将日本血吸虫的3个重要蛋白编码基因亚克隆入质粒p8KD相应位点构建了转移质粒，并将其与rPRV/LacZ基因组DNA共转染Vero细胞，经检测表明，获得的重组病毒有效表达了血吸虫特异性蛋白。这为进一步研制PRV和日本血吸虫病二价疫苗提供了借鉴。在狂犬病及犬瘟热等犬类烈性传染病的新型疫苗研究中，伪狂犬病病毒

20、也常被用作活病毒载体。袁子国等逆以PRVBarthaK61株为载体，将eG-FP-rgp的表达框克隆入其中，获得rPRV/eGFP/rgp重组病毒，以期研制正向表达狂犬病病毒8202株糖蛋白的重组活载体疫苗。LiYW等mi经RT-PCR方法获得了犬瘟热弱毒苗Onderstepoort株的H基因，以带有PK基因的质粒p8AA为转移载体，以LacZ为报告基因，构建转移质粒p8AAZH。再将p8AAZH与PRVBartha-K61株病毒基因组共转染入BHK-21细胞，使二者在细胞内同源重组并包装出毒。经过反复的筛选与鉴定，获得了纯化的重组病毒rPRV-H,同时也对重组病毒的生物学特征进行了研究。目前

21、，针对犬瘟热已经报道构建了多种活载体疫苗，但免疫保护力较低，伪狂犬病病毒具有黏膜嗜性，易引起机体免疫反应，利用这一特点可以开发对犬使用更加便利的口服疫苗，具有广阔的应用前景。由上述研究可以看出，以PRV作为载体的重组病毒在防控病毒病上研究较多，在寄生虫病上的研究也取得了初步的成果。不同的病毒对机体的致病机理基本相同，所以用重组病毒防制病毒病不存在问题；但是由于寄生虫对宿主的免疫效应具有免疫逃避的机制，这就为以PRV作载体研制的疫苗能否有效的防控寄生虫病提出了挑战。仅仅在体外重组了PRV和寄生虫的基因、获得了表达是不够的，还需要考虑到病原体的特性和病原体与机体之间的联系，所以以PRV作为疫苗载体

22、防控寄生虫病的研究还需要进一步深入；另外，可否将PRV应用在细菌病的防控也是未来值得探索和研究的方向之一。3展望PRV基因组容量大，有许多非必需基因，动物感染谱广，不感染人。PRV的基因缺失株是表达外源基因的优良载体，也是构建重组活病毒载体疫苗的基础。重组病毒进入机体刺激产生多种免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫，并且与自然感染时的真实情况很接近，可以避免重组亚单位疫苗的很多缺点。而且其激发的免疫应答水平通常不低于完整外源病原产生相应成分后引起的免疫强度。由于重组病毒基因组中插入了一个或多个外源抗原性基因，所以在表达PRV基因的同时，也表达了外源基因，从而对其他病原体产生免疫应答。

23、伪狂犬病病毒活载体疫苗可以达到兼防多种疾病的目的。目前的研究大部分只是缺失了PRV的2个3个基因，构建了二联或三联的重组病毒，由此可以联想，伪狂犬病病毒具有如此庞大的基因组和多个病毒增殖非必须区，一定可以插入多个外源基因，来研制更多价的重组活疫苗，用来防控动物的多种常见疫病，这样便可省去使用多种疫苗的繁琐，同时也可节省大髭的人力和财力，为生产实际带来效益。目前的问题是究竟外源基因插入到哪些病毒复制非必须区才能得到有效表达，不同抗原间是否有拮抗作用等还需要进一步的研究和筛选。综上所述，PRV病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点，所以研制这样的多价基因工程活载体疫苗被认为极具开发和应用前景

24、。构建重组病毒、细菌或寄生虫活载体疫苗已成为当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一。目前国内还没有成熟的产品上市，但相信以伪狂犬病病毒为载体的活疫苗的研制，将会为动物疫病的防控提供强有力的技术支撑。参考文献：1 股震.刘景华.动物病毒学M,北京：科学出版社，1997：998-1009.2 袁章，郭万柱，余光勇.等.猪伪狂犬病奏载体的研究进展J.安微农业科学，2007,35(6),1673-1674.3 KluppBGHengartnerCJ,MettenleiterTC.etal.Complete.annotatedsequenceofthepseudorabiesvirusgenomeJ.J

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