人乳头瘤病毒L2蛋白的病毒样颗粒疫苗研究.docx

1、doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.016人乳头瘤病毒L2蛋白的病毒样颗粒疫苗研究蒋蓉李军强杨鸣鸣朱涛宇学锋邵忠琦（天津康希诺生物技术有限公司，天津市呼吸道细菌重组及结合疫苗企业重点实验室，天津300457）中图分类号R373.9R392-33文献标志码A文章编号10004MX(2016)03_03664)6摘要目的:构建乙肝病毒核心抗原(HBcAg)与人乳头瘤病毒(HPV)L2抗原的融合蛋白.在大肠杆菌中重组表达形成病毒样颗粒结构;通过小鼠模型检测HBc-L2融合蛋白的免疫原性，并研究免疫后获得的小鼠血清对HPV假病毒的中和效力。方法:通过DNA合成构建

2、16型人乳头瘤病毒12基因片段与HBcAg基因的融合基因，将其克隆至表达载体PET9a并在大肠杆菌中进行HBc-L2融合蛋白表达;将经纯化、鉴定后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测小鼠血清中针对12抗原的抗体效价，并分别研究小鼠血清对16型和18型HPV假病毒的中和效力。结果:HBc-L2融合基因经大肠杆菌系统表达形成可溶性蛋白，经硫酸铉沉淀和CL4B凝胶分离纯化后获得纯度>80%的HBc-L2蛋白；分子筛高效液相色谱-多角度激光光散射(SEC-MALS)联用技术和透射电子显微镜的分析结果表明,HBc-L2融合蛋白在表达过程中自动组装形成稳定的病毒样颗粒;将纯化后的

3、HBc-12蛋白免疫BALB/c小鼠可获得针对12抗原的高滴度抗体,且小鼠血清具有中和16和18型两种假病毒的中和抗体活性。结论:HBc-12病毒样颗粒可以有效地增强12抗原的免疫原性，并可剌激机体产生针对多型HPV的免疫保护力，是一个具有潜力的新型广谱HPV疫苗。关键词人乳头瘤病毒;12抗原;乙肝病毒核心抗原;病毒样颗粒;免疫原性；中和抗体Studyofavirus-likeparticlevaccinecontainingN-terminalepitopesofhumanpapillomavirusL2proteinJIANGRong,LIJun-Qiang,YANGMing-Ming9Z

4、HUTaoyYUXue-FengtSHAOZhong-Qi.TianjinCanSinoBiotechnologyInc.TianjinCorporateKeyLaboratoryofRespiratoryBacterialRecombinantandConjugateVaccinetTianjin300457,ChinaAbstractObjective:Toprepareavirus-likeparticle(VLP).containingHepatitisBviruscoreantigen(HBcAg)andN-terminalpeptidesoftheL2proteinofhumanp

5、apillomavirus(HPV),andinvestigatetheimmunogenicityoftheVLPinmiceandtheprotectionagainstdifferentstrainsofHPV.Methods：AfusiongenewassynthesizedtoinsertaDNAfragment.codingfortheN-terminalepitopesoftheL2proteinofHPV16,intotheHBcAgcodingsequence;HBc-L2fusionproteinwashighlyexpressedinE.coliusingthepET9a

6、andBL2(DE3)expressionsystem；thepurifiedfusionproteinwasusedtoimmunizeBALB/cmiceandantibodytitersagainsttheL2epitopesinmouseseraweredeterminedbyindirectELISA；thelevelsofneutralizingantibodiesagainstbothHPV16and18werealsoanalyzed.Results：HBc-L2fusionproteinwasexpressedinE.coliandpurified,withthepurity

7、>80%,byammoniumsulfateprecipitationandCL-4BgelGltration；analysisofthepurifiedfusionprotein,usingsizeexclusionchromatographywithmulti-anglelaserlightscatteringdetection(SEC-MALS)andelectronmicroscope,revealedthatHBc-12wasassembledintoastableVLPstructureautomaticallyfollowingitsexpression;immunizat

8、ionofBALB/cmicewiththepurifiedVLPsresultedinhighantibodytitersinmouseseraagainstthe12epitopes；furthermore,itwasdemonstratedthattheserafromtheimmunizedmicehadneutralizationactivitiesagainstbothHPV16andHPV18.Conclusion:TheimmunogenicityoftheL2epitopeswashighlyenhancedbytheconstructionofHBc-L2fusionpro

9、teinandtheformationoftheVLPstructure;thefusionproteinwasalsocapableofinducingprotectionsagainstdifferentserotypesofHPV,therefore,itcouldbeapotentialHPVvaccinewithabroadcoverageandlowproductioncostKeywordsHumanpapillomavirus;L2peptide;HepatitisBviruscoreantigen；Virus-likeparticles;Immunogenicity;Neut

10、ralizationantibody人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)是作者简介:暮蓉（1986年-）,女，硕士，高级技术员，主要从事病原微生物免疫学方面研究，E-mail：rong.jiangcansino-o通讯作者及指导教师:邵忠琦（1962年-）,男，博士，研发总监，主要从事疫苗研发方面研E-mail：zhongqi.shaocansinotech,conu一种无包膜双链DNA病毒，能引起子宫颈癌、生殖器疣等肿瘤疾病或癌症。宫颈癌在妇女中发生率位列第二，在发展中国家发生率明显高于发达国家。统计表明,我国每年新增宫颈癌患者约15万人左右，且年轻患者比例上升明显

11、。近年来，运用重组DNA技术制备基因工程HPV疫苗的研究获得了突破性进展。L1与12基因分别编码HPV的主要及次要衣壳蛋白，L1蛋白约占衣壳蛋白80%以上，能自动组装成病毒样颗粒(Virus-likeparticle,VLP)；12蛋白在衣壳蛋白中含量:少于20%,且无法单独形成VLP。国外已上市或获批的产品，如默沙东四价、九价加德西(Gardasil,HPV6,11,16,18；HPV6,11,16,18,31,33,45,52,58)与葛兰素史克二价卉妍康(Cervarix,HPV16,18)均利用L1自身形成VLP结构的原理进行研制。但这些疫苗生产工艺复杂、价格昂贵，无法广泛满足市场，尤

12、其是发展中国家低收入人群的需求。研究表明，接种氨基酸序列较为保守的12蛋白能诱导产生涵盖多种血清型HPV的保护力，但S蛋白或L2多肽本身免疫原性较低。通过将E2与Toll样受体2(TLR2)融合、在腺伴随病毒颗粒骨架中插入12多肽抗原或将经修饰的细菌鞭毛蛋白(Fha)与L2融合等方法均可以提高L2的免疫原性,并获得具有中和多种血清型HPV的免疫血清(8-，01o本研究选用的两个E2蛋白的N-端多肽在不同型的HPV间具有较强保守性,并在早期研究中被证实对HPV16、18、31具有一定交叉保护活性重组的乙肝病毒核心抗原(HepatitisBviruscoreantigen,HBcAg或HBc)可在

13、大肠杆菌中高效表达,易纯化，并能自身组装形成VLPO构建合适的HBc与目标抗原融合蛋白，将目标抗原展示在HBc形成的VLP表面，能有效地提高目标抗原的免疫原性。ACAMBIS公司将流感M2e蛋白插入HBc制备了ACAM-FLU-A的新型通用型抗流感疫苗，该疫苗具有较好的免疫原性及保护性，并已经进入临床研究阶段。除病毒疫苗之外，HBc载体还被广泛运用于细菌、寄生虫等多种病原疫苗研究E】o本研究将两段16型人乳头瘤病毒L2抗原多肽(1347位与65-81位氨基酸)偶联后作为抗原片段插入到HBc蛋白中，在大肠杆留中表达融合蛋白并自动组装成VLP。研究结果显示,HBc-I2病毒样颗粒显著增强了12多肽

14、抗原的免疫原性，所获得的小鼠血清具有中和16型与18型HPV的能力。此项研究为开发广谱、低成本的宫颈癌疫苗提供了一个新途径。1材料与方法1.1材料1.1.1假病毒、细胞、菌株与动物HPV16.HPV18假病毒与阳性血清由北京微谷生物医药有限公司馈赠;293FT细胞由华中农业大学农业微生物国家重点实验室曹胜波教授馈赠；感受态BL2A(D”)、DH5a与T载体购自全式金生物技术有限公司;SPF级BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司;pET9a载体、pFN2K(GST)FlexiVector购自Promega公司。1.1.2试剂和仪器DMEM培养基.0.25%胰酶、胎牛血清购自Gib

15、co公司；HRP羊抗鼠IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司;T4连接酶、限制性核酸内切酶BamHI、NdeI、PmeI与AsiSI购自NewEnglandBiolabs公司；质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，胶回收试剂盒购自全式金生物技术有限公司;SepharoseCL-4B购自GE公司，GSTSEPHAROSE购自索莱宝公司；蛋白纯化仪为AktaPrimePlus(GE公司)；流式细胞仪为MilliporeguavaeasyCyteHT,荧光显微成像系统为尼康TE2000U,透射电子显微镜为FEITecnai20o1.2方法1.21表达载体的构建本研究中采用的HBc蛋白为去掉C-端1

16、64183位氨基酸的截短蛋白，取而代之的是一个半胱氨酸。在HBc蛋白178位置上插入了两个抗原片段,分别为L2蛋白13-47位和6581位氨基酸片段。插入到HBc的12多肽序列为ASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIA-DQILQ和GTGGRTGYIPLGTRPPTo融合基因(包括两端的BamHI和A&I酶切位点)委托LifeTechnology公司合成构建。将扩增的DNA片段经Bam/H和N&I双酶切后回收目的基因，然后与经同样酶切的载体质粒pET9a连接。连接产物转化挑取并纯化卡那霉素抗性菌落；阳性克隆经LB培养基扩增后提取质粒进行酶切鉴定，将获得的HB

17、c-U融合基因的表达质粒命名为pET9a-HBc-L2o委托Invitrogen公司合成以下两个DNA引物：5'-GCGATCGCTCAACTTTATAAAACATGCAAACAG-V与5-GTITAAACTTAAACCTTAGGTATAATGTC-AGGT-3'。以12融合基因的表达质粒pET9a-HBc-12为模板，加入上述引物,PCR扩增12抗原编码片段。将PCR产物与T载体连接，对获得的质粒进行和P*I双酶切，胶回收L2目的条带，将其与经同样酶切的载体质粒pFN2K(GST)FlexiVector连接。连接产物转化DH5a,挑取卡那霉素抗性菌落，阳性克隆经LB培养基扩增

18、后提取质粒进行酶切鉴定，将获得的表达质粒命名为PGST-L2。1.2.2重组融合蛋白的表达与纯化将表达质粒PET9a-HBc-L2转化BI21(DE3),挑取卡那霉素抗性菌落，纯化后接种LB培养基进行扩增，在培养液中加入20%甘油，分装后于-80Y保存菌种。取冻存偏种接种至10mlLB培养基，373C摇菌过夜复苏;转接入400ml新鲜培养基扩大培养至ODg,约0.6-0.7时，加入1mmol/LIPTG,25Y诱导4h；离心收集萌体，用TGEbuffer(50mmol/LTris,0.5mmol/LEDTA.50mmol/LNaCI,5%甘油)重悬细胞；超声破碎后高心收集上清，加入10%w/v

19、(NH4)2SO4沉淀蛋白，用TGEbuffer重悬沉淀，收集币:忌液并用0.22滤膜过滤,然后用100kD膜包超滤浓缩。用CL-4B凝胶对浓缩液进一步分离纯化，收集日的蛋白。将表达质粒pGST-EZ转化B12(DE3)感受态细胞获得GSTJ2表达隋株。取冻存菌种接种10mlLB培养基,37Y摇曲过夜复苏；转接入400ml新鲜培算基扩大培弄至()D颂约0.60.7时，加入1mmol/LIPTG,37T诱导4h;离心收集菌体，用PBS币:悬细胞;超声破碎后离心收集沉淀。加入200ml8rnol/L尿素过夜溶解包涵体.离心收集上清，浓度梯度透析至PBS中，经GSTSEPHAROSE柱纯化，收集目的

20、蛋白。1.2.3病毒样颗粒大小和形态的分析鉴定采用分子筛高效液相色谱(SEGHPLC)及HPLC-多角度激光光放射(MALS)联用技术鉴定蛋白纯度和VLP颗粒大小。激光放射仪与色谱分离系统连接将泵头放入经0.22过滤并超声后的流动相后.流速调至0.1ml/min,柱体平衡后分别对BSA和待测样品进行检测。委托中国科学院生物物理研究所蛋白质实骑平台生物成像中心采用透射电子显微镜进行VLP形态观察。1.2.4小鼠免疫与血清样本制备分别对两个批次HB<-I2(HBc-I2-1与IIBc-12-2)病存样颗粒样品和一批GST-I2融合蛋白样品进行免疫原性研究。实验动物为体重10-12g的BALB

21、/c小鼠，共104Ho每批HB<-I2VLP样品设四个浓度组，分别为20、10、5、1W只，每组1。只小鼠；GST-L2样品设两个浓度，分别为20J0叫/只，每组7只；另设阴性对照组,10只小鼠.注射生理盐水。所有组别均在0天皮下注射5005对应样品，第14天、28天分别进行第二和第三次免疫。分别在免疫第28、42天采血,6000r/min高心8min,分离血清,-20弋暂存。1.2.5间接ELISA检测抗体效价配制5jig/mlGSTJ2蛋白溶液，10()山/孔包被的标板，4弋过夜。0.05%TweenPBS洗3次，加入I%BSA2(X)./孔，37W育2h；PBST洗3次，加入待检血

22、清(HBe-12实验组)100W孔,37弋孵育.Ih；PBST洗3次，加入HRP-羊抗鼠IgG100jd/孔,375育1h；PBST洗5次，加入TMB底物显色1015min；每孔加入50心的2mol/LH2SO4终止显色反应，酬标仪检测。1)蜘读数'检测GST-12融合蛋白免疫后获得的血清时，采用HBc-12包被酶标版.检测步骤同1.01.2.6HPV中和抗体检测在96孔细胞板每孔中加入100p.1293FT细胞悬浮液，含1.5x10个细胞,37,5%CO2培养6ho待测血清(HBc-12三免血清)经56Y灭活30min后按1：15J：30、1：60J:120进行系列稀释，阴性血清(未

23、免疫小鼠血清)处理后仅进行1：15稀释。根据假病毒提供方的研究数据，分别对PsV16和PsV18进行1：200和：100稀祥。将假病毒和血清按I：1进行混合检于4Y共孵育60min,再将混合液加入已培养6h的细胞板中,37龙、5%C()2继续培养“。72h培养结束后用荧光显微镜观察EGFP荧光表达。观察结束后，奔去培养基,每孔加入0.25%胰酶205,37Y消化5min,每孔加入200心10%FBS的DMEM培养基顶恐细胞并转移至新的96孔板，用Milli|x»reguavaeasyCyteHT流式细胞仪进行分析1.3统计学分析组间差异选用，检验进行分析，/yo.05为差异具有显普性

24、。2结果2.1表达质粒的构建编码HBc-12的融合基因氏度为663bp,表达出的融合蛋白大小约为24kl)o如图1A所示，将构建的HBc-12表达载体pET9a-进行HamH|和Nde双能切，得到两个大小分别约为670bp和4300bpDNA片段，与融合基因编码片段和PET9a载体大小相符。经验证.GST.12的表达载体AsiS|和RneI双胸切后进行电泳.条带大小分别约为107bp和3765bp,也与预期的质粒大小及基因片段一致(图IB)o图1表达载体双酶切鉴定图Fig.1RestrictiondigestionofexpressionplasmidsNote：A.DigtMion<&

25、gt;TpET9aHB<12uithHamH|andA</rI；B.Digc-HticHiofp(JST-12withAsiS|andPmr|.2.2HBc-L2取组蛋白的表达IPTG诱导表达结束后，高心收集倘体;超声破碎细胞后分别对上清和沉淀中的蛋白进行SDS-PAGE分析。电泳结果（图2）显示，IPTG诱导后上清和沉淀样品中均出现了一条约为24kl）的明显蛋白条带，与HBc-12融合蛋白的理论分子量相符。因此.HBc-12融合基因可在大肠杆菌有效表达，获得产物主要为听溶性蛋白，少部分形成包涵体。2.3蛋白纯化与病毒样颗粒的鉴定对细胞破碎上清进行硫酸铉沉淀处理（图3A）,夏溶并超

26、滤浓缩，并用CL4B分子筛层析进一步纯化，在外水体积收集到蛋门峰（图3B.峰I）;对所获样品进行蛋白电泳，结果如图3C所示，样品中目的蛋白纯度大于80%,主要杂质为分子ht约30kD的蛋白。用SEC-HPLC方法对纯化的HBc-12融合用白进行分析。HBc-12分子仙约为24kl）,而结果显示HBc-12贺白的出峰时间远早于66kl）的BSA（出峰时间约23min）,表明该蛋白并不以单体形式存在,而是自组装成大分子结构（图4A）；SEC-HPLC-MAlt联用技术分析结果进一步表明，狭得的HBcL2融合蛋白分子M大，且分布集中、结构均一（图4B）O通过透射电f显微镜对两批纯化的HBc-12进行

27、观察（图5）,镜卜可见大依均一分布、直径约为30nm的圆形颗粒，与报道的HBr病成样颗粒相符,&明构建的融合蛋白HBc-12能有效门动包装形成大分子病毒样颗粒。2.4血清抗体效价对小取,二次与三次免疫后的血清进行抗12抗体效价检测，结果如图6所示。二次免疫后.低剂ht组（1或5jig）血清中滴度达到10“左右，而高剂帝组（1。或20吓）抗体滴度已接近或超过IO%图6A）；三次免疫后，各剂ht组抗体图2HBc-IJ诱导表达鉴定Fig.2ExpressionofHBcI2afterinductionN(Mc：M.Markrr;lame1.Solublefractionofcelllysat

28、r；Ine2.Insolublefractionofcelllysatr.滴度较二免结果略有增加（图6B）,但没有显著差异（P>0.05）o比较不同批次的样品,HBc-L2-2较HBr-12-l的免疫原性似乎更强，但两批间差异不显著（P>0.05）o上述结果表明,HBc-L2具有良好的免疫原性,二次免疫即诃刺激机体产生高滴度的抗12抗体，且不同批次样品的结构和免疫原性较-致。图6C为GST-I2融合蛋白免疫小鼠所得结果。高剂址（I。和20»ig）GST-12蛋白三次免疫后，血清中抗12的抗体效价分别为102或10远低于HBc-12的免疫效果。因此tHBc-L2形成的VLP

29、可有效地增强12抗原的免疫原性。2.5HPV中和抗体检测小鼠免疫血清对两种HPV假病推（PsV16与PsV18）的中和效力.初步评价HB（-I2疫苗的保护性和广谱性。如图7所示,PsV16与PsV18能有效感染293FT'细胞，阴性对照血清（1：15倍稀释）对假病毒感染效力无影响，镜下可观察到大量:感染后表达荧光的细胞。当将小鼠免疫血清（1：15倍稀释）与PsV16、PsV18分别共孵育72h后，PsV16与PsV18的感染能力明显被抑制，镜卜仅能找到极少表达荧光的细胞，1：30、1：60和1：120稀释度的免疫血清与PsV16或PsV18共孵育.图3HBc-IJ«合带白纯化

30、Fig.3PurificationofHBcI2fusionproteinNote:A.SDS-PAGEanalynisofNimplmbeforeandafteranmioniusulfateprecipitation；B.SDS-PAGEanalysisofsaniplrsbeforeamiafterCL-4Bgelflhnition；C.PurificationofHB<'-I2byCL-4BgelGItralionchronuitograpliy:A：M.Marker；I.Cellly»atebeforeinduction;2.Celllysateafterin

31、duction:3.nuprmatantafterAmmoniumsulfateprecipitation:4.TGEHupenxionofAmmoniumMilfalcprecipitation;5.Precipitateafterrentrirugation；6.Suprmatantafterrrntrifugitlion；B：M.Marler；1.HBcL2beforeCL-4Bp*lGltnili<»n；2.HBc12afterCL-4Bgrlfiltration.图4HBC-L2融合蚤白分子大小分析Fig.4AnalysisofsizeofHBc-Ufusionpro

32、teinNote：A.SE-HPLCanalysisofHBc-L2；B.SEC-HPIX-MALSanalysisofHBc-12.图5HBc-IJ病毒样颗粒电子透镜鉴定Fig.5ObservationofHBol2virus-likeparticlesbyTEMNote：A.HBe-12-l；B.MlIBc-U-lMMBt-LM图6血清中抗L2抗体滴度检测Fig.6AntiL2antibodytitersinmouseseraNote：A.AftertwoinjectionswithHBc-12;B.AfterthreeinjectionswithAfterthn-einjet'l

33、ionwithGSTI2.GST4U后，也对两个假病春的感染效力有不同程度的抑制（结果未显示）。将细胞消化转移后进行流式分析.结果显示阴性对照血清对假病毒无中和作用,PsV16与其共再育后感染细胞.约有16%细胞表达荧光。当PW16与1：15J：30、1：60、1：120四个梯度稀释的小鼠免疫血清共孵背后，检测出感染荧光细胞比例分别下降至4.48%、7.54%、9.32%与11.23%。PsV18与阴性血清反应后感染细胞，可以检测到约11%的细胞表达荧光。、1PsV18与4个梯度稀释的小鼠免疫血清共孵育后感染细胞，所检测荧光细胞比例分别为3.46%,4.81%、9.61%、11.96%。图7H

34、PV假病毒中和试验荧光采集Fig.7FluorescenceassayofHPVpseudovirionneutralization综合显微镜观察和流式细胞仪分析结果.HB<-12免疫小鼠后获得的血清具有中和16型HPV的能力，并对18型HPV病毒也有较强交叉中和活性'3讨论引发宫颈癌的人乳头痛病屉上要包括HPV6、II、16、18、31、33、45、52与58等血清型15。国外已上市的疫苗均采用主要衣壳蛋白L】作为抗原七要成分，但L1蛋白具有较强型特异性，不能覆盖其他血清型的病毒，6jr,需分别制备不同型的疫苗组分以形成多价制剂。山蛋白在昆虫细胞与酵时细胞中表达量低，制备工艺复

35、杂，生产成本高，S0而世界上约有80%的宫颈癌病例发生石发展中国家，昂贵的HPV疫苗无法使这些地区的人群完全受益”o因此，开发更广潜、更经济的宫颈癌疫苗势在必行。研究表明，次要:衣壳蛋白12虽不威F维持病毒结构的主要蛋白,在病毒表面含ht相对较少，但能与次级病毒受体结合从而促进病毒基因组从胞内体向核内转移，与乳头痛病毒感染有更要联系如。但12免疫原性相对较弱，极大限制K基于12抗原的疫苗开发。近年来，人们开展r大站的研究以增强12抗原的免疫原性和保护性，Tumban等利将HPVI6的12短肽插入到编码MS2病毒样颗粒的质粒后，小鼠模型免疫原性得到明显提高。Tyler等E将含有12蛋白整合到Q。

36、咚萌体VLPI*免疫小鼠血清能有效中和PW16、18、3I、45、58多种血清型假病毒，证实广以12制备的HPV疫苗具有更广泛的中和保护力。本研究中，我们将两个16型HPVI2蛋白N端具有交叉保护功能的多肽抗原插入到HB。蛋门中，在大肠杆菌中表达获得HBc-I2融合蛋白，并证明经纯化的HBc-I2自动组装形成了VLP结构。由于HBc-L2可在细菌中高效表达,VLP纯化过程简单且收率高，生产成本将能得到有效控制。在小鼠试验中,HBc-L2二免及三免血清中针对12的特异性抗体滴度能达到10'1。6,免疫效果远高于不能形成VLP结构的GST-L2融合蛋白。因此，将L2抗原多肽展示在HBc形成

37、的VLP表面E能有效增强12抗原的免疫原性。通过假病毒中和试验，进一步证实了HBc-E2VLP免疫后血清不仅可以显著地中和16型HPV的感染效力，对18型HPV也有较强中和活性。综上,HBc-12VLP可能成为一个生产成本低，且对不同血清型有广泛覆盖率的新型HPV疫苗。HPV外壳表面主要是L1蛋白，12蛋白数量相对较少，因此，基于L2抗原的HPV疫苗能否达到足够保护性是一个需要在临床试验中回答的关键问题。HBc-L2VLP良好的免疫原性，以及获得的免疫血清对HPV16和HPV18具有交叉中和活性，无疑为该疫苗的进一步开发打下坚实基础，也为基于以蛋白的疫苗开发提供了有力支持。我们将在后续试验中对

38、添加佐剂是否会增强HBc-UVLP的免疫原性，以及体内动物模型中该疫苗是否能有效降低HPV的感染率等问题进行研究。我们也将进一步改进HBc-L2的组成和结构，增强其免疫原性，使该疫苗可以覆盖更多血清型的HPV。参考文献：J姜志欣，吴玉确.HPV感染及预防性HPV疫苗研究J.中国计划生育学杂志,2008.16(5)：315-317.2JYuDY,Xuexinchun.TherelationbetweenhumanpapillomavirusandcervicalcancerJ.PortHealthControl,2003,8(1)：40-45.3 GongYL,SuDM,LiuYA.Constr

39、uctionofprophylacticHPVvaccinesutsinggeneticengineeringtechnologyJ.ChinaBiotechnol.2008,28(9)：130-134.4 WangD,LiZ,XiaoJ,ela/.Identificationofbroad-genotypeHPV12neutralizationsiteforPan-HPVvaccinedevelopmentbyacrossneutralizingantibodyJ.Plx>SOne,2015,10(4):eO123944.5 PrinuCFDAapprovesGardasil9form

40、oretypesofHPVJ.Cancer,2015,121(8):1156-1157.6 CladelNM,BudgeonLR,BaloghKK,e*al.Anovelpre-clinicalmurinemodel(ostudythelifecycleandpixressionofcervicalandanalpapillomavimsinfectionsJ.PLoSOne,2015,10(3)：eO12O128.7 ChenX,LiuH,ZhangT.etal.Avaccineof12epitoperepeatsfusedwithamodiGedIgGlFcinducedcross-neu

41、tralizingantibodiesandprotectiveimmunityagainstdivergenthumanpapillomavirustypesJ.PLoSOne,2014,9(5):e95448.AlphsHH.GambhiraR,KaranamB,rtal.ProtectionagainstheteroltouHhumanpapillomaviruschallengebyasyntheticLipopeptidevaccinecontainingabroadlycross-neutralizingepitopeofL2J.ProcNat)AcadSciUSA,2008,10

42、5(15)：5850-5855.NietoK,WeghoferM,SehrP,etal.DevelopmentofAAVLP(HPV16/31L2)particlesasbroadlyprotectiveHPVvaccinecandidateJ.PIx)SOne.2012,7(6)：e39741.KalninK,TibbittsT,YanY,elal.Lowdosesofflagellin-L2multimervaccinesprotectagainstchallengewithdiversepapillomavirusgenotypesJ.Vaccine,20)4,32(28)：3540-3547.ConwayMJ.CnizL,AlamS.rfal.Cross-neutralizationpotentialofnativehumanpapillomanrusN-terminal12epitopesJ.PLoSOne,2011,6(2)：el6405.PaulPumpens,UrichK,SasnauskaK,etal.Medicinalproteinengineering'M.BocaRatonLondonNewYork：CPCPress,2008: