MTT细胞实验中药物浓度筛选详解

1、（一）试验前应明确的问题 1. 选择适当的细胞接种浓度。一般状况下，96孔培育板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预试验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培育时间，以保证培育终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观看不到差异。 2. 药物浓度的设定。肯定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。依据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的

2、有效浓度和时间。 3.  时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最终得到不同时间点的抑制率变化状况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应当就是最好的时间点（由于这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。 4. 培育时间。200ul的培育液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，假如养分不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。 5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞确定数。做MTT时，尽量无菌操作，由于细菌也可以导致MTT比色OD值的上升。&

3、#160;6. 理论未必都是对的。要依据自己的实际状况调整。 7. 试验时应设置调零孔，对比孔，加药孔。调零孔加培育基、MTT、二甲基亚砜。对比孔和加药孔都要加细胞、培育液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对比孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8. 避开血清干扰。用含15胎牛血清培育液培育细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸取值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10胎牛血清的培育液进行。在呈色后，尽量吸净培育孔内残余培育液。 （二）试验步骤 贴壁细胞： 1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺

4、板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2. 5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实状况.3. 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观看。 4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），连续培育4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培育液，当心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培育液。

5、0;5. 终止培育，当心吸去孔内培育液。 6. 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7. 同时设置调零孔（培育基、MTT、二甲基亚砜），对比孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培育液、MTT、二甲基亚砜） 悬浮细胞： 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将补足的1640（无血清）培育基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培育液稀释 l?g/ml，需预试查找最佳稀释度，1:10-1

6、:20)；需检测物10ul；细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对比（加100?(储存液100 1640）。 2）置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观看。 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），连续培育4 h。（悬浮细胞推举使用WST-1，培育4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 4）离心（1000转x10min），当心吸掉上

7、清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5）同时设置调零孔（培育基、MTT、二甲基亚砜），对比孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培育液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 （三）MTT的配制 MTT一般最好现用现配，过滤后4避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避开反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培育板中加，没必要一

8、下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就确定不能再用了。 MTT有致癌性，用的时候当心,有条件最好带那种透亮的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，到底时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60水浴助溶。 PBS配方:Nacl 8g，Kcl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调ph 7.4，定容1L。 （四）关于细胞的接种(铺板) 细胞过了30代以后就不要

9、用了,由于状态不好了;培育板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预试验。 接种时最好依据预试验摸索出的密度接种, 由于细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。假如铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，由于细胞长的太快养分会不够，最终导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多接受10000/ml，100ul/孔。 细胞密度要依据不同细胞的特点来定.假如你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，假如你做

10、的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对比的区分更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.（五）加入MTT 个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系的确不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些 MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。假如不使用96孔板，培育基超过100ul，MTT依据10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培育基混匀，不过这个应当关系不大。 如加入MTT后都有个别孔马上变为蓝黑色，则污染

11、的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在镜下观看，看看是否有孔染菌，染菌的孔经常是接近的。由于血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。假如不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可。首先说说我的一点阅历： 1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较简洁混匀。10ml的离心管里面最好装34ml的悬液：悬液太少简洁吹起很多气泡，悬液太多又不简洁吹成单细胞悬液。 2. 吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，

12、这样吹打简洁起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。假如是吸液量1ml多的吸管，总液量在5ml左右为益 3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则简洁吹打出气泡。 4. 吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打3050次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以肯定的速度吸取悬液。） 5. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发觉细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中心，而周边很少，这种不均匀的分散会产生

13、接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在来回回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是MTT试验的关键，也是基础，肯定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最终细胞全死了，建议不要接受这种方法混匀细胞。 其它的声音：  1. 首先细胞的接种密度肯定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。 2. MTT本身就是比较粗的试验，增殖率10%左右的波动都不算惊异。特殊是新手，20的波动也是常见的，所以很可能是技术缘由引起的，特殊是种板技术肯定要过关。 3. 我做的是肿瘤细胞的MTT试验,这种细胞长的很快一开头我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过4000080000/ML的浓度都做过MTT试验,结果发觉做的结果比较好点的是6000070000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,