H5亚型高致病性禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗接种后气管黏膜损伤的研究.docx

1、H5亚型高致病性禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗接种后气管黏膜损伤的研究疫病毒活载体疫苗接种后气管黏膜损伤的研究!董俊斌*,马学恩】，步志高2(1.内蒙古农业大学动物科学与医学学院，内蒙古呼和浩特010018；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001)中图分类号:S852.65'9.5文献标识码:A文章编号;1004-7034(2010)01-0007-04关键词：H5亚型高致病性禽流感病毒;HA基因；重组新城疫病毒；气管黏膜损伤摘要：为了研究H5亚型高致病姓禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活裁体疫苗rLaSota-HA(GD)的

2、免疫机理，用rLaSot&-HA(GD)免疫2日龄SPF雏鸡，分别在接种后的1,3,5,10,15,18天取气管进行电镜、光镜观察，利用免疫组化染色(IHC)方法检测病毒在气管内的分布。结果表明：接种rLaSota-HA(GD)后第1天纤毛细胞有脱纤毛现象，杯状细胞破碎，黏液成分增多，黏膜下层的纤维裸露在表面上，并可看到纤毛细胞的纤毛上有球形粒子，杯状细胞、基细胞大量增生；接种后第18天纤毛细胞脱纤毛区域进一步增大。接种后第3天黏膜下层水肿，淋巴细胞、粒细胞、浆细胞浸润，黏膜上皮形成空泡状，表层由数层不成熟的细胞组成；接种后第10天腺体腔闭塞。免疫组化染色可见气管固有层细胞呈阳性反应，

3、棕色颗粒出现在胞浆中。结果说明气管黏膜的损伤是机体重要的防御机制和免疫机制的表现。ThachealepitheliumlesionofchickensvaccinatedwithrecombinantNDVLaSotavaccinestrainexpressingHAgeneofH5highlypathogenicityAvianinfluenzavirusDONGJun-bin",MAXue-en1,BUZhigao2(1.TheCollegeofAnimalScienceandMedicine,InnerMongpliaAgriculturalUniversity,Hohhot0

4、10018vChina；2.XationalKrylboralor),ofVeterinaryBiotechnologytHarbinVeterinaryResearchInstitutetChineseAcademyofAgriculturalSciences,llarhin150001,China)Keywords:H5highlypathogenicityAvianinfluenzavirus；HAgene；recombinantNDV；thachca!epitheliumlesionAbstract:Vaccinationwasgivenbyeyedropandintranasally

5、inslillationwithrl冬Sota-HA(GD)(2x106EiDjo/chicken)totwo-day-oldSPFchickenafter1,3,5,10.15,18days.Thetrachraswerecollected.Uhrastructuralchangesinthetrachralrpilheliumwereexaminedbyscanningelectronmicroscopy.Onday1postvaccation(PV)scanningelectronmicroscopyrevealedhypertrophyofgobletcellandsmallpat-c

6、hcij*ofthedeciliatrdepitheliumaroundthedisorientedanddeformedcilia.Ondays1PVhyperplasiaofgobletcellsarcomiKaniedbyanin*creaseinmucus.Ondays1PVglobularparticlesfoundinareasofthetracheaepitheliumwilhtipsofciliaadheringtothemtgobletcellsandbasalcellregenerated.Non-ciliatedplaqueswereobserveduntildayi8P

7、V.Buttheygradually<iecrrasr<linsize,iuglitmicroscopyshowedsmallvacuolescontaininglymphocytesandheterophilsplasmacelkintheepithelia)layer.Thesubmucosaisslightlyedematous,immatureepi*theliumproliferatedinsomeareas.Thetracheaislinedwithseverallayersofiminuturecellsondays3PV.Thereishyperplasiaofmu

8、cousglandcellscausingnarrowongorobliterationofglandularlaminainimmunohistochemical(IHC)stainingondays10PV.Sprcilficstainingwaslocalizedinthrsubmucosacells.Thisresponseisprobablyanattemptbythemucociliarydefensemechanism.1999年，欧洲学者率先建立了第1个高致病性新城疫病毒的反向遗传操作系统(reversegeneticsystem,RGS)(,：O研究表明，新城疫病毒基因组在不

9、同位点插入外源报告基因或免疫原基因，经细胞或鸡胚收稿日期:2008-12-26;修回日期：2009-10-28基金项目：“973"国家重点基础研究计划项目(2OO5CB5232OO)作者简介：董俊斌(1975-)，女(蒙古族)，博士研究生.通讯作者：步志高(1965-)厚，研究员，博士.连续高代次传代仍保持高度的遗传和表达稳定性l，-41o笔者选择生产实践中广泛应用的、免疫效果良好的新城疫病毒Sota弱毒疫苗株建立了相应的反向遗传操作系统，成功救获了野生型病毒株，在此基础上进一步构建了表达H5亚型高致病性禽流感免疫原HA基因的重组新城疫病毒.前期试验结果证明救获的重组病毒板Sota-

10、HA(GD)保持了LaSota亲本株良好的鸡胚生K适应性、高度生物安全性及遗传稳定性,免疫维鸡可分别对新城疫病毒强毒及H5亚型高致病性禽流感病毒的致死攻击形成完全保护,用其预防新城疫和H5亚型高致病性禽流感病毒具有良好的应用前景。试验用H5亚型商致病性禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗rLaSo-ta-HA（GD）接种2日龄SPF雏鸡进行气管黏膜损伤和病毒定位研究，并对其免疫机理进行了初步探讨。1材料1.1试验动物SPF雏鸡，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。所有SPF雏鸡免疫试验均在哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供的负压隔离器中进行。1.2抗体和疫苗免疫组化一抗（抗新城

11、疫病毒NP蛋白单克隆抗体）、rLaSota-HA（GD）,由哈尔滨兽医研究所外来病实验室构建、保存。1.3主要试剂DAB显色试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；美国ZYMED公司Sp-9000免疫组化忒剂盒,购自北京中山生物技术有限公司。2方法2.1试验动物分组将24只2日龄SPF雏鸡随机平均分成2组，第1组为阴性对照组，用PBS接种;第2组为试验组，用rUSota-HA（GD）毒株接种（本组中免疫组化空白对照组为试验组组织在染色过程中用PBS代替一抗）。2.2接种分别用PBS.rLaSota-HA（GD）毒株（以效价2乂仔曰口如）经滴鼻、点眼途径人工免疫2日龄SPF雏鸡,每只鸡100ji

12、L;分别在接种后的1,3,5,10,15,18天取2只鸡以心脏注气的方式处死，取气管放在固定液中待做电镜观察和H.E,染色、免疫组化染色。2.3房理诊断、尸体解制和电镜观察每天对各组鸡观察2次，记录临床症状，于接种后1,3,5,10,15,18天分别取2只鸡进行尸体解剖，取气管上部大小为10nn»x10nun的组织固定在3%戊二醛中，然后置于0.1mol/L、pH值为7.4的缓冲液中4乞固定4h；l%俄酸中4弋作用30min；用PBS缓冲液连续洗6次,梯度酒精脱水，临界点干燥;喷金;扫描电镜观察。2.4H.E.染色取气管上部大小为16n）n）x30mm的组织经4%多聚甲醛固定24h,

13、按常规方法制作石蜡切片，H.E.染色,光镜下观察。2.5免疫组化染色（过钗化物酶标记的链毒卵白素S-P法）分别将各组鸡气管16mmx30mm的组织经4%多聚甲醛固定24h,按常规制作石蜡切片，进行免疫组化染色。试验中所用一抗为抗新城疫病毒NP蛋白单克隆抗体，工作效价为1：600。将载玻片放入二甲苯（1）二甲苯（n）100%乙醇（I）一100%乙醇（H）95%乙醇85%乙醇一75%乙醇一50%乙醒,每种试剂中放10min；用纯化水冲洗，PBS浸泡5min；脱蜡后用PBS溶液冲洗3遍，加入3%H2O,溶液中孵育10min；然后倒掉H2O2,在纯化水中洗3次;再加入柠檬酸缓冲液，放入烧杯中在微波炉中

14、蒸煮,至沸腾时断电，冷却至室温（10min）,反复蒸煮2次;冷却至室温后将柠檬酸缓冲液倒掉，并将载玻片置于PBS中洗2次（每次5min）；加上5%BSA封闭液.然后室温放置20min；将载玻片上的多余液体甩去，加一抗（抗新城疫病毒NP蛋白单克隆抗体，空白对照试验即在组织切片上用PBS代替一抗）；加完一抗在4乞冰箱中保存过夜，放入PBS中洗3次，每次5min；加二抗（生物素标记抗鼠IgG）,然后置于37龙温箱中20min；加过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液，放入PBS中洗3次，每次5min；加上辣根前标记的链酶卵白素工作液，置于37乞温箱中作用2（）min；将切片从温箱中取出，放入PBS中洗3次

15、，每次5min；擦干组织周围的PBS后加上显色剂（显色剂的配制:在1mL水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀，再加1滴显色剂C,摇匀,20-37乞保存），镜下控制显色时间;将显色后的切片用清水冲洗一段时间后浸泡于苏木精中染色；将复染后的片子置于水中冲洗，然后放入50%乙醇一75%乙醇一85%乙醇一95%乙醇一100%乙醇（I）-100%乙醇（U）二甲苯（I）一二甲苯（II）,每种试剂中放置5min；封片，镜下观察结果。3结果3.1电镜观察结果所有的试验鸡接种后未出现明显的临床症状，也没有明显的呼吸道病理反应。在PBS接种的阴性对照组可以清楚地看到气管黏膜上皮是由纤毛细胞和杯状细胞

16、组成的，大部分杯状细胞处于静止态,处于分泌期的特别少，静止态的杯状细胞表面有颗粒状的微绒毛和少量的球状结构，纤毛细胞的肝毛排列整齐（见图1）。试验组从接种后的第1天开始均有纤毛细胞纤毛脱落、倒伏的现象（见图2）；接种后的第3,5,7,10天纤毛脱落区域进一步加大;从接种后的第15天开始纤毛细胞的纤毛开始恢复,能看到新生的纤毛。对于试验组，从rdSota-HA（GD）毒株接种后的第1天开始静止态的杯状细胞减少,而处于分泌态的杯状细胞开始增多（见图3）；接种后的第3,5天气管黏膜的杯状细胞超常增生，数最增多，益液成分增多第10天杯状细胞增生，破碎程度进一步加大;从接种后的第18天开始杯状细胞分泌程

17、度下降，轻度分泌。图1对照组气管黏膜(SEM,1000x)Fig1Thetrachealinthecontrolgroup(SEM,1(XX)x)图2接种后第1天气管黏膜（SEM,】000x）Fig2Thetrachealafter1daypostvaccation(PV)(SEM.l(XX)x)接种后第3天黏膜上皮形成空泡状，血管内皮细胞肿胀,黏膜表面扭曲，浆细胞浸润,表层由数层不成熟的细胞组成，血管明显;接种后第10天黏膜肿胀，引起腺体腔狭窄甚至闭塞;接种后第18天淋巴细胞仍有浸润（见图6）。图5气管黏膜扭曲，淋巴细胞，巨噬细胞浸润(H.E.,400x)图6气皆黏膜淋巴细胞、巨噬细胞浸润(

18、H.E.,200x)Fig6Thesubmucosainfiltratedbymacrophagesandlymphocytes(H.E.,20()x)图3增生的杯状细胞(SEM,750x)Fig3Hyperplasiaoftheglobletcells(SEM,750x)用rUSota-HA（CD）毒株接种后第1天开始能明显地看到少玷的带有微绒毛的球形粒子（见图4）,基细胞大埴增生，带有微绒毛的球形粒子大小为34pin,可能是免疫性淋巴细胞的前身，接种后第18天球形粒子基本消失。3.3免疫组化染色结果rLaSota-HA（GD）毒株接种后第1天就发现气管黏膜的固有层淋巴细胞、腺体细胞呈阳性反

19、应，褐色颗粒出现在胞浆内（见图7）。空白对照组免疫组化染色阴性，阴性对照组免疫组化染色阴性（见图8）。图7气管黏膜F层有褐色颗粒(IHC.200x)Fig7Specilficstaininglocalizedinthesubmucosace!ls(IHC,200x)图4气管黏膜上长有微绒毛的球形粒*(SEM,7000x)Fig4Alotofglobularparticlesfoundinlocalizedareasofthetracheaepithelium(SEM,7000x)3.2光镜观察结果接种后第1天杯状细胞破碎，黏膜细胞肿胀，黏膜下层淋巴细胞浸润，巨噬细胞浸润，黏膜扭曲，纤毛细胞脱纤

20、毛，管腔内含有脓性纤维,黏膜下层水肿，血管内皮细胞肿胀，淋巴细胞浸润在血管中（见图5）；图8阴性对照狙气筲黏膜(IHC,200x)Fig8NospecificsUiningincells(IHC,200x)4讨论Fig5Themucosalsurfaceisdistorted.thesubmucosaisimfiltratedbymacrophages,lymphocyte(H.E.,400x)用rLaSota-HA(GD)免疫2日龄雏鸡后，雏鸡并没有出现临床症状。顷MC和IbrahimAL用新城疫病毒鼻内接种雏鸡后，第5天发现气管黏膜的杯状细胞特别活跃，接种后第7天纤毛细胞有脱纤毛现象。在本

21、试验中，接种后第1天就看到纤毛细胞有脱纤毛现象。这种对气管纤毛系统的损害在时间E的差异可能是由于病毒的毒力不同导致的。对气管黏膜系统的损害可能是外来病毒、细菌和刺激物共同作用的结果叩】。仓鼠气管黏膜在受到损伤后3648h开始再生，纤毛细胞在60-96h开始恢复纤毛,120h后全部恢复。黏膜上皮细胞随时间变化的情况同上述报道是相似的。有报道称:锥鸡通过,雾接种新城疫BI菌株能引起雏鸡气管病理组织学变化'I；受到应激的禽类更容易受到病毒的影响，气管黏膜的损伤更严重，更容易受到支原体的感染。试验中，纤毛细胞脱纤毛现象是接种rLaSola-HA(GD)后的主要反应，气管黏膜上皮细胞的最早反应是

22、杯状细胞的破碎和增生，气管呈卡他性炎症，黏液成分大皇出现;黏膜下层淋巴细胞、粒细胞、浆细胞浸润，黏膜上皮细胞形成空泡状，黏膜表面扭曲.表层由数层不成熟的细胞组成；腺体腔狭窄，甚至闭塞。新城疫病毒B1菌株接种后能发现淋巴细胞浸润，这不是由于病毒感染产生的病理反应，而可能是免疫反应的表现。淋巴细胞浸润说明有病毒刺激淋巴细胞产生抗体。气雾接种的锥鸡气管黏膜浸润的淋巴细胞、气管腺体细胞、黏膜表面细胞都是产生免疫反应的主要细胞。有试验已经证明气管黏膜是产生lg(；、IgA特别是IgA的主要场所，气管黏膜损伤可能是黏膜纤毛防御机制的表现,黏液成分的增多可能对外来入侵的病毒和细菌起到稀释作用。纤毛细胞的脱纤

23、毛现象大大降低r黏膜对外来病毒和细菌的抵抗能力,有利于弱毒疫苗进入体内产生相应的抗体，所以在接种后的儿天里纤毛细胞的纤毛减少。接种后第10天，在纤毛上能发现34Jim的球形粒子，可能是淋巴细胞的前身，也可能是机体免疫系统的反应。免疫组化结果表明，rLaSola-HA(CD)出现在固有膜的淋巴细胞、腺体细胞胞浆中，这说明其在气管内能明显夏制。病毒的复制在胞浆内进行,接种后第1天就能检测到病毒说明病毒的复制能力较强。5结论作为预防新城疫和传染性法氏囊病的重组二联活病毒疫苗rLaSota-HA(GD),接种后第1天免疫组化染色rlqSota-HA(GD)出现在固有膜的淋巴细胞、腺体细胞胞浆中，这是导

24、致机体发生免疫反应的前提条件。气管黏膜损伤表现为纤毛细胞脱纤毛，杯状细胞破碎、增生，黏液增多，淋巴细胞、粒细胞、浆细胞浸润，腺体腔闭塞，这是机体防御机制和免疫机制的表现。参考文献：1PEETERSBPH.DELEEUW0S,KOCHG.etal.RescueofNewcastledimviscvirusfromclonedcDNA:evidencethatcleavabili-tyofthe(unionproteinisamajordeterminantforvirulenceJ.JournalofVirology,1999,73；5001-5009.2 ENGEL-HERBERTAJ,OKT

25、RUDWB,JENSP,ctal.CharacterizationofarecombinantNewcastlediseasevirusexpressingthegreenfluorewenlproteinJ.JournalofVirologicaJMethods,2002,108：19-28.3 KRISHNAMUHTHYS,HLANGZ,SAMALSK.Recovejyofavirulentstraind-NewrasllediseasevirusfromclonedcDNA:expres*sionofaforeigngeneresultsingrowthretardalionandattenuationJ,ViroJt>gy,2000,278；J68-182