C群脑膜炎球菌结合物小鼠免疫原性的研究.docx

1、论著C群脑膜炎球菌结合物小鼠免疫原性的研究孔素娟'，袁菲'，王欣茹I,王晶'，刘爱萍'，于旭博'，吴兵I,罗树权'，侯亚莉I,谢贵林21. 兰州生物制品研究所有限贵任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046；2.中国生物技术股份有限公司，北京100029摘要：目的比较C群脑膜炎球菌多糖蛋白质结合物（简称结合物）的相对分予质量大小和免疫剂量对其在小鼠体内免疫原性的影响，为结合物的分子大小的质控和结合疫苗成品免疫剂量的选择提供实验依据。方法利用CDAP活化法制备C群脑膜炎球菌结合物.通过硫酸铉盐析进行纯化，然后利用SepharoseCL-

2、4B凝胶过滤层析分析,并根据化学检测结果将结合物分为A0-0.2（蛆分1）0.2-0.4（组分2）、匕0.4-0.7（组分3）等3个不同相对分子质量组分,每份分别采用10jigA2jig的免疫剂量免疫小鼠，并对血清进行EUSA分析。结果采用1.0jig免疫剂量时,3种不同相对分子质量:的C群脑膜炎球菌结合物均能产生较高水平的抗体，具有典型的加强效应，第2剂免疫即可产生高水平的抗体，而第2、3剂免疫后的抗体水平差异无统计学意义;采用0.2必免疫剂量时，三种不同相对分子质量的C群脑膜炎球菌结合物只有在第3剂免疫后才能产生较高水平抗体，第I、2剂免疫后的抗体水平差异无统计学意义，组分1和组分2在第3

3、剂免疫后产生的抗体水平优于组分3；对于相同相对分子质量结合物，用1.0jig免疫小鼠产生的抗体水平优于0.2jig免疫组，而且有显著的统计学意义。结论高剂量时，多糖相对分子质鼠大小对C群脑膜炎球慎结合物的免疫原性没有显著性影响;低剂量时,小相对分子质量结合物对其免疫原性有影响。同等相对分子质挝时J.Ojig比0.2ag的免疫剂量时以激发更高的抗体水平。关键词:C群脑膜炎球菌多糖蛋白质结合物;相对分子质量大小;免疫剂量;免疫原性；免疫应答中图分类号：R512.3文献标志码：A文章编号：1005-5673（2016）01-0007-07DOI：10.13309/ki.pmi.2016.01.002

4、ImmunogenicityinmiceinfluencedbygroupCmeningococcalconjugatesKONGSu-juan,YUANFei,WANGXin-ru,WangJing,LIU-Ai-ping,YUXu-bo,WUBing,LUOShu-quan,HOUYa-li,XIEGui-linLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorresponding

5、author:XIECui-Un.,E-mail:guilxiel956Abstract:ObjectiveThemicewereimmunizedbygroupCmeningococcalconjugateswithdifferentmolecularsizesanddifferentdoses,thentheimmunogenicityandrelatedinfluencewerecomparedandanalyzed.Basedontheexperimentresult,thescientiGcbasiswasprovidedinqualitycontrolofmolecularsize

6、forconjugatesandoptimalselectionofdoseforgroupCmeningococcalconjugatevaccine.MethodsGroupCmeningococcalconjugateswerepreparedbyCDAPactivationandpurifiedbyammoniumsulfateprecipitation,anddividedintoKo0.0-0.2(partI),KF)0.2-0.4(partII),K。0.4-0.7(partIII),thenprocessedandanalysedbySepharoseCI.-4BGltrati

7、on.Immunizedmicewith1.0|igor0.2展doseofeachpart,andimmunizedserawereanalyzedbyELISA.ResultsThreeconjugateswithdifferentmolecularsizein1.0pugdosestimulatedhighlevelsofIgGantibodies,withatypicalenhanceeffect.TheconjugatesevokedhigherlevelsofIgGantilxxliesaftertheseconddose,llierewasnotastatisticaldiffe

8、renceinantibodylevelsgeneratedbetweenthesecondandthirddose.Immunizedwith0.2p,gdoseinmice,threeconjugatesstimulatedhigherlevelantibodiesonlyafterthe基金项目：国家“重大新药创制”专项（2013ZX09402-302-215）；甘肃省科技重大专项（0801NKDA003）作者简介:乱素娟（I980-），女，助理研究员，主要从事多糖蛋白结合疫苗的研制工作。通讯作者：谢贵林,研究员，E-mail：gui】xiel956thirddose.Therewasn

9、otastatisticaldifferenceinantibodylevelsgeneratedbythefirstandsecondimmunization.ThepartIandpartUconjugatesproducedhigherlevelsofantilx)(ythanpartIDafterthethirdimmunization.Asimmunizedwithsamemolecularsizeconjugates,1.0dosegroupsproducedantibodylevelwashigherthan0.2doseones,whichhadasig-nificantsta

10、tisticaldifferencesinantibodylevels.ConclusionInhighdoseirntnunizationgroups,ithadnoapparentinfluencetotheimmunogenicityfromthreeconjugateswithdifferentmolecularsize,andimmunogenicitycouldl)einfluencedbyconjugatewithsmallmolecularsizeatalowdose.Incomparison,thehigherinirnunorrsponsecouldbeinducedbyi

11、mmunizationwith1.0p,gdosethan0.2dose.Keywords：GroupCmeningococcalconjugates;Molecularsizeimmunizationdose;Immunogenicity；Immunoresponse多糖疫苗具有良好的免疫原性，但对2岁以下婴幼儿免疫效果不理想，而结合疫苗接种后可产生胸腺依赖性免疫应答，并诱导免疫记忆，可以为所有年龄组受种者提供良好的保护力。因此，对于结合疫苗的研究很有必要。由于荚膜多糖的相对分子质量范围较广，呈现多分散性的特点，另外，目前使用的结合方法无法得到相对分子质量均一的结合物，因此制备的结合物相对分

12、子质量分布也较宽，如果仅收集Kd值0.2之前的结合物组分,将大大降低结合物的收率;而且结合物相对分子质量过大，将对除菌过滤以及临床使用的安全性评价带来影响，因此有必要对不同相对分子质量大小的结合物进行系统的比较，为结合物相对分子质量大小的质控提供实验数据。诺华公司的四价脑膜炎球菌结合疫苗采用降解多糖，利用氨还原法制备结合物，并利用离了交换层析的方法纯化结合物，结合物的相对分子质量大小仅有100000左右；葛兰素史克(GSK)公司的四价脑膜炎球菌结合疫苗利用CDAP活化的方法制备结合物，然后利用分子筛进行纯化，结合物的相对分子质量高达百万。两种结合疫苗的相对分子质量大小会有很大的差异，但均可在目

13、标人群中产生较高保护力的抗体水平，因此，除了相对分子质量大小以外还要考虑免疫剂量等因素对于结合物免疫原性的影响。实验以C群脑膜炎球菌荚膜多糖作为原料，利用CDAP活化法制备结合物,通过硫酸铉盐析法对结合物进行纯化，然后利用SepharoseCL-4B层析将结合物分成K。0-0.2、K»0.2-0.4、Kd0.4-0.7等3个部分，并参考目前上市的脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球荣结合疫苗的免疫剂量，采用1.0pig、0.2%的剂量免疫小鼠，比较相对分子质量大小和免疫剂量对结合物在小鼠体内免疫原性的影响。1材料11样品C群脑膜炎球菌荚膜多糖，批号：试201305001；破伤风类毒素(TT)衍

14、生物，批号：试201407002,均获自兰州生物制品研究所有限贵任公司(简称兰州公司)。12主要试剂及仪器1-械基-4二甲察基毗嗟四氟硼酸盐(CDAP)、乙腊、三乙胺(TEA)均购自Sigma-Aldrich公司；硫酸铉，购目国药集团化学试剂有限公司；微性磷酸的标记的羊抗鼠IgG(货号1030-皿)，购自美国南方公司；96孔前标板(Costar92592)购自美国Corning公司；AKTAprimeplus型层析系统.SepharoseCL-4B凝胶及XK16/100层析柱均购自GE公司；高效液相-十八角激光散射仪(HPSEC-MALLS)购自Wyatt公司；酶标仪(SpectraMAX19

15、0)购自美国MolecularDevices公司°13实验动物雌性N1H小鼠，体重12-14g,由兰州公司实验动物室提供,合格证号：医动字第14-002号。2方法C群脑膜炎球茵结合物制备2.1.1制备结合物依据参考文献5方法制备结合物，称取3()mgC群脑膜炎球菌英膜多糖.用1.5mL0.2mol/L氯化钠溶液将多糖配制成20mg/mL,溶解过夜；向多糖溶液中加入0.3ml,10()mg/mLCDAP/乙睛溶液，调节pH值至5.8左右，反应30s；用0.2mol/LTEA将pH值调至7.3,if时反应5min；将pH值调至8.2左右，加入1.5mL20mg/mLTT衍生物，维持pH值

16、8.2反应4ho反应完成后，用0.2mol/L氯化钠溶液透析°透析后的结合物溶液中加入饱和硫酸铉溶液进行盐析纯化,除去其中的游离多糖。2.1.2结合物的处理和分析用SepharoseCL-4B凝胶过滤层析系统分析结合物，分布收集的样品参考中国药典三部(2010版)附录VIC方法测定唾液酸含量、参考附录IIA方法测定28。nm处吸光度，参考文献6测定游离多糖含量。根据化学测定图谱收集匕0-0.2、K。0.2-().40.4-0.7等3个不同相对分子质信组分，以卜简称组分1、组分2、组分3。1.2 C群脑膜炎球菌结合物化学检测2.2.1化学测定对组分1、组分2、组分3测定唾液酸含量(依据

17、唾液酸含量计算多糖含量)、参考中国药典方法附录vib测定蛋白质含量、附录mB测定游离蛋白含量,测定游离多糖含量。2.2.2高效液相一十八角激光散射仪测定以高效液相一十八角激光散射仪测定3个组分样品的重均相对分子质量。2.3免疫学实验231动物实验将实验小鼠随机分为7组，每组10只。组分1、组分2、组分3的结合物均分成2组,免疫剂量分别为1.0腿、0.2昭，共6组。另外一组为免疫剂量5.0瞄的C群脑膜炎球菌多糖,作为对照组。于小鼠皮下注射结合物,0.1mL/只，注射时间为0、14、28d,采血时间为7、21、35d。第、2剂免疫后从小鼠脸颊采血，第3剂免疫后摘除小鼠眼球采血,离心后分装血清冻存。

18、2.3.2免疫双扩散试验依据中国药典三部(2010版)附录切C,抗原分别为3种相对分子质量的结合物。抗体为精制破伤风抗毒素血清、C群脑膜炎球菌免疫血清。2.3.3酶联免疫吸附试验依据参考文献8和9方法，用10mmol/L的PBS将C群脑膜炎球菌多糖溶解为5pig/mL,以100口1孔加入酶标板，于28丁放置过夜。用含氮化钠、氯化钾、TrizmaBase、TrizmaHCl.Brij-35(30%w/v)的洗板液洗板5次后，加入含氯化钠、氯化钾、TrizmaBase、TrizmaHC1、牛血清白蛋白的封闭液,150似/孔,37T放置2ho稀释检测用血清：免疫组小鼠血清，根据血清的免疫剂次，第1剂

19、免疫后采集的血清用1：50稀释;第2剂免疫后采集的血清用1:100稀释;第3剂免疫后采集的血清用1:500稀释;C群阳性标准血清11C,ELISA单位为400EU/mL,按1：400稀释，混匀后按100仇/孔加入酶标板，作2倍系列稀释。置28无过夜。洗板5次，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(l-4000稀释)，100pjy孔,37X.放置2h。洗板5次，加入1mg/mL对-硝基苯磷酸盐，100孔,25T避光显色2h。按50pL/孔加入3mol/LNaOH终止液。用酶标仪读出波长的4值。根据标准血清中的IgG含量计算待检血清的IgG抗体ELISA单位。3结果3.1盐析纯化后的C群脑膜炎球菌结合

20、物的化学测定图诺将盐析纯化后的C群脑膜炎球菌结合物利用SepharoseCL-4B层析系统进行分析，对收集的样品检测多糖含量、蛋白质含量、游离多糖含量。从结合物的层析图谱(图1)可以看出，制备的结合物相对分子质量分布范围较宽，呈现典型的多分散性;经盐析纯化后，结合物的游离多糖含量处于较低水平。0.500.45（）.400.350.500.45（）.400.35迥（）.30安（）龙5会0.200.150.100.050KD图1盐析纯化后的C群脑膜炎球菊结合物化学测定图谱Fig.1DiagramforpurifiedgroupCmeningococcalconjugatesanalyzedbySe

21、pharoseCL-4BgelfiltrationO8642O«K)H2OA11111111ooooo.o.o.().o.().o.().().o.o3种相对分子质量C群脑膜炎球菌结合物化学测定结果对3种不同相对分子质量的结合物样品分别进行多糖含量、蛋白质含量、游离多糖含量的测定，结果见表"表13种不同相对分子质量C群脑膜炎球菌结合物化学测定结果Tab.1Threeconjugateswithdifferentmolecularsizebychemicaldetection结合物多糖含量蛋白质含员(|ig/mL)多糖与蛋白质比值游离多糖含量(%)游离蛋白含量(%)回收率(%

22、)&值组分1103.21132.910.783.661.4130.30.00组分294.43127.370.744.161.7232.20.26组分336.0081.490.447.314.9015.30.44从检测结果可以看出组分1和组分2结合物的多糖与蛋白质比值相似，均在0.75左右，组分3结合物的多糖与蛋白质比值偏低，仅为0.44,因为游离蛋白质与组分3相对分子质量接近，硫酸铉盐析将部分游离蛋白也沉淀下来，导致组分3多糖与蛋白质比值较低、游离蛋白含量较高;各组分结合物的游离多糖质量分数均在10%以下，说明通过硫酸铉盐析纯化有效地去除了结合物中的游离多糖;经分子筛层析将硫酸按盐析纯

23、化后的结合物分成3个组分,3个组分的多糖质量比约为2：2：1O3种相对分子质量的C群脑膜炎球茵结合物HPSEC-MALLS检测结果经测定,组分1、组分2和组分3结合物的重均相对分子质fit分别为2.687X1()6(g/mol)、8.127x1()5(g/mol)、5.037xl05(g/mol)o3种相对分子质量结合物的HPSEC-MALLS的图谱，见图2。3.2 3种相对分子质量C群脑膜炎球菌结合物免疫双扩散检测结果3种相对分子质量的结合物都可与C群脑膜炎球菌免疫血清和精制破伤风抗毒素形成沉淀线，说明3种结合物均具有良好的抗原性，见图3。14.016.018.()20.0时间(min)注：

24、I：Kd0-0.2；2：Kifi.2-0.4；3：Ko0.4-0.7图23种相对分子质htC群脑膜炎球俏结合物HPSEC-MALI5检测图谱Fig.2DiagramforthreeconjugateswithdifFrrentmolecularsizebvHPSEC-MALLS注:A：Kd(M).2；B：KdO.22.4；C：Ko0.4-0.7；1：精制破伤凤抗寿索血清;2：C群脑膜炎球演免疫血清图3.3种相对分子质htC群脑膜炎球侑结合物免疫双扩散检测结果Fig.3Threeconjugateswithdifferentmolecularsizedelectedbydoubleinununo

25、diusion3.5ELISA检测结果3种相对分子质仙结合物采用2种免疫剂ht免疫小鼠后血清中特异性IgG抗nngw体含仙见表2,相对分子质故大小和免疫剂ht对结合物免疫原性的比较结果见图46。图4相对分子质bt大小和免疫剂缺对C群脑膜炎球曲结合物的免疫原性比较Fig.4immunogenicityinmiceinfluencedbymolecularsizeandimmunizationdotieofgroupCmeningococcalconjugates表2C群脑膜炎球菌结合物免疫小鼠后血清中特异IgG抗体含量Tab.2ThemousespecificIgGantibodylevelsp

26、roducedbyimmunizationofthreeconjugates样品剂量剂次GMU95%可信区间(w?)下限上限组分I1.010.140.021.082133.867.26438.533396.19194.22808.160.210.010.010.0120.180.011.33356.050.71140.80组分21.010.020.010.05253.130.3281.5】3254.2611.25908.870.210.010.010.0120.080.010.98333.602.53102.09组分31.010.010.010.01251.813.35169.433264.6

27、1163.91427.170.210.020.010.0620.040.010.3130.940.0518.98多糖对照5.010.010.0J0.0120.010.010.0130.010.010.01图51.0剂量3剂次间小鼠免疫血清中特异IgG抗体含量的比较Fig.5ComparisonofthemouseIgGantibodylevelsforthreedosesof1.0p.gconjugate图60.2幅剂量3剂次间小鼠免疫血清中特异IgG抗体含量的比较Fig.6ComparisonofthemouseIgGantibodylevelsforthreedosesof0.2pigco

28、njugate从表2和图46可以看出,3种相对分子质量大小的结合物采用1.0jig的剂量免疫小鼠后，均可在小鼠体内产生高水平的特异性IgG抗体,并且具有典型的加强效应，血清中的抗体含量在第2剂免疫后即处于较高水平，同一相对分子质量结合物在第2、3剂免疫后的小鼠血清抗体含量均无统计学意义（P值分别是0.199.0.132和0.089）；不同相对分子质量结合物在第2、3剂免疫小鼠血清中的抗体含量也均无统计学意义（第2剂比较:组分1比组分P=0.981；组分1比组分3,P=0.373；组分2比组分3,P=0.332o第3剂比较:组分1比组分2,P=0.529；组分1比组分3,P=0.547；组分2比

29、组分3,P=0.967）。3种不同相对分子质量的结合物采用0.2jig的剂量免疫小鼠，第2剂免疫后血清中的抗体含量处于较低水平，只有在免疫3剂后，组分1和组分2小鼠免疫血清中才能产生较高水平的特异性抗体，组分3第3剂免疫后小鼠血清的特异性抗体仍处于较低水平。同一相对分子质量结合物免疫组的第3剂免疫血清中的特异性抗体含量要明显高于第2剂，而且差异均有显著的统计学意义（P值分别是0.000、）.000和0.001）;不同相对分子质量结合物的第2剂免疫小鼠血清中的特异性抗体含量无统计学意义（组分1比组分2,P=0.394；组分1比组分户=0.135；组分2比组分3,P=0.508）；组分1在第3剂免

30、疫后小鼠血清中的特异性抗体含量要高于组分2,但差异无统计学意义（F=0.621）,组分1、2的第3剂免疫血清中抗体含量明显高于组分3,差异具有显著的统计学意义（组分1比组分3,P=0.000；组分2比组分3,P=0.001）o4讨论C群脑膜炎球曲荚膜多糖是由N-乙酰神经氨酸作为重复单位组成的多聚物，原糖的相对分了质弘范围较广，呈典型的多分散性。选择不同的结合工艺（多糖是否需要降解、不同结合方法以及不同纯化手段等）制备的结合物的相对分子质量大小有很大的差异，无法产生相对分子质量均一的结合物，在结合物制备过程中如何对相对分子质量大小进行有效的控制,使最终得到的结合物可诱导良好的免疫原性尤为重要。选

31、用CDAP活化法制备结合物,利用硫酸铉盐析进行纯化，经SepharoseCL-4B凝胶过滤层析分析后,发现结合物呈现范围较宽的相对分子质量分布。通过MALLS分析看出结合物相对分子质量从儿万到几百万不等，因此需要选择性的收集特定相对分子质量大小的结合物。如果只选择K2.2之前的大分子组分，尽管可以保证较高的免疫原性,但使结合物的回收率降低，不利于今后的疫苗生产。如果选择全部组分的结合物，应该对小相对分子质觉组分的免疫原性进行深入的研究。对于免疫剂缺的选择，参考已上市的脑膜炎球菌结合疫苗的资料，1999年以后惠氏公司、凯龙公司和百特公司先后推出了单价C群脑膜炎球菌结合疫苗，剂量均采用10g-,o

32、;2OO5年以来，赛诺菲巴斯德公司、诺华公司和葛兰素史克公司先后推出了四价脑膜炎球菌结合疫苗，剂量分别是4/4/4/4牌（A/C/Y/W135群多糖含量，赛诺菲巴斯德E）、10/5/5/5淄（诺华'）和5/5/5/5|xg（GSK,31）o2006年以来国内上市的A群、C群脑膜炎球菌结合疫苗，剂量均采用10口g;辉瑞公司推出肺炎球菌结合疫苗Prevnar7和Prevnarl3采用的剂量是2展和4>ig,GSK公司的10价肺炎球菌结合疫苗Synflorix的剂量是1|ig或者3|ig14o这些疫苗的免疫剂轼有很大的差异,但是选择合适的剂型均获得了良好的临床应用效果。研究利用硫酸铉盐

33、析的方法对结合物进行纯化，小相对分子质量结合物的多糖与蛋白质比值要比大相对分子质咻结合物偏小，仅有0.44,主要的原因是由于硫酸铉盐析是将蛋白质和结合物共同沉淀,仅起到去除游离多糖的效果，无法去除游离蛋白质,2009年Lee等"发表文章证明向结合物中加入高含政的游离蛋白质对结合物的免疫原性没有显著的影响，因此，研究纯化的3组分结合物不考虑游离蛋白质对免疫原性的影响。比较了相对分子质量大小和免疫剂挝对C群脑膜炎球曲结合物的免疫原性的影响，结果显示3种蛆分在1.0状剂量时小鼠体内产生的抗体水平无显著差异，并且都有明显的加强效应;在0.2jxg剂鼠时大、中相对分子质量组分加强效应优于小相对

34、分子质量组分;结果与Lee等报道的结果一致。当结合物组分的收集范围较宽时，1.0网的小鼠免疫剂量可以激发各组分更高的抗体水平;剂地较低时对于小的相对分子质量的结合物组分可以考虑通过佐剂的添加提高其免疫原性。在结合物的制备中，通过结合方法的优化提高高分子结合物含量的同时，应综合相对分子质量的选择以及免疫剂量，以获得最终更好的疫苗保护力c参考文献GaspariniR,PanattoD.MeningococcalglycoconjugatevaccinesJ.HumVaccin.2011,7(2)J70-182.2BanlottiA,AveraniG,BertiF,etal.Physicochemi

35、calcharacterisationofglycoconjugatevaccinesforprrventionofmeningococcaldiseasesJ.Vaccine,2008,26(18)：2284-2296.I3BiemansRL,BoutriauD,CupiauC,etal.Immunogeniccomposition：US8431136：P.2013-04-30.4SanfordM.Pneumococcalpolysaccharideconjugatevaccine(13-valenl,adsorbed):inolderdduhsJ.Drags,2012,72(9)：1243

36、-1255.5ShaferDE.TollB,SchumanRF,etal.ActivationofsolublepolysaccharideswithI-cyaiio-4-dimeihvlaminopyridiniumtetrafluoroborate(CDAP)foruseinprotein-polysaccharideconjugatevaccinesandimmunologicalrragents.II.SelectivecrosslinkingofproteinstoCDAP-activatedpoiysafcharidesJ.Vaccine,2000,18(13) ：1273-128

37、1.6.LeiQP>LambDH,HellerR,ftal.Quantitationoflowlevelunconjugatedpolysaccarideintetanustoxoid-conjugalevaccinebyHPAEC/PADfollowingrapidseparationbydeoxycholate/HCL(Jl.PharmBiomedAnal,2000,21(6)：1087-1091.7 刘方蕾.吴兵，侯亚莉，等.C群脑膜炎球俏家兔免疫血清的制备及其群待界性和相关方法专属性分析】.中国生物制品学杂志.2014.27(11)：】421-1425.8 刘佳，王欣茹,赵志强，等.13价肺炎结合疫苗小鼠血清EUSA方法的建立与验证J、.中国新药杂志,20)4,23(18):2144-2149.9王欣茹，赵志强,李亚男，等.人血清中A、C、Y、WI35群脑膜炎球俏英膜多糖IgG抗体含金ELISA检测方法的建立