CCK8检测细胞增殖毒性的原理及注意事项

1、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及留意事项一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而精确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。用途：药物筛选、细

2、胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8的优点：· 使用便利，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；· CCK-8法能快速检测；· CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；· CCK-8法的重复性优于MTT 法；· CCK-8法对细胞毒性小；· CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。CCK8的缺点：· 与MTT法相 比，CCK8和XTT的价格比较贵。· CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培育基颜色接近，不留意的话简洁产生漏加或多加。与以往的增殖/毒性测定试剂相

3、比较：检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水溶性差（需加有机溶剂溶解）好好好产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm细胞毒性高，细胞形态完全消逝很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以格外适合格外适合格外适合便捷程度一般便捷便捷格外便捷二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法试验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中：依据合适的铺板细胞数

4、，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。3、37培育箱中培育：细胞接种后贴壁大约需要培育2-4小时，假如不需要贴壁，这步可以省去。4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻小扣击培育板以挂念混匀。或者直接配置含10%CCK8的培育基，以换液的形式加入。5、培育1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。假如显色不够的话，可以连续培育，以确认最佳条件。特殊是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。6、测定450nm吸光度：建议接受双波进步行测定，检测波长450-490n

5、m，参比波长600-650nm。试验二：细胞毒性分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中：依据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。3、37培育箱中培育：细胞接种后贴壁大约需要培育2-4小时，假如不需要贴壁，这步可以省去。4、加入不同浓度的毒性物质5、37培育箱中培育：加入毒性物质的培育时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要依据细胞周期来打算，起码要一代以上的时间。6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻小扣击培育板以挂念混匀。7、培育1-4小时:细胞种类不同，形成的Forma

6、zan的量也不一样。假如显色不够的话，可以连续培育，以确认最佳条件。特殊是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。8、测定450nm吸光度：建议接受双波进步行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。注：· 若临时不测定OD值，可以向每孔中加入10 L 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培育板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。· 假如待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新颖培育基（除去培育基，并用培育基洗涤细胞两次，然后加入新的培育基），去掉药物影响。当然药物影响

7、比较小的状况下，可以不更换培育基，直接扣除培育基中加入药物后的空白吸取即可。三、CCK8检测细胞增殖/毒性的留意事项· 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 l 培育基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推举接种量不低于2,500 个/孔 (100 l 培育基)。· 酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。· CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖试验每次测定的过程中需要避开细菌污染，以免影响结果。· CCK-8在0-5下能够保存至少6个月，在-20下避光可以保存1年。· 当在培育箱内培育时，培育板最外一圈的孔最简洁干燥挥发，由于体积不精确而增加误差。一般状况下，最外一圈的孔只加培育基，不作为测定孔用。· 在培育基中加入CCK8，培育肯定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对比。在做加药试验时，还应考虑药物的吸取，可在加入药物的培育基中加入CCK8，培育肯定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对比。· 金属对CCK-